程义云ACS Nano：以树形高分子作为模板合成可有效灭活肿瘤的超小型、多功能化光热剂

【摘要】

超小型多功能纳米粒子用于光热癌症治疗非常有前景，但这些纳米颗粒的合成仍然存在问题。最近，华东师范大学程义云教授等人使用树形聚合物作为模板合成超小光热剂，并使用多功能团改性处理。

树状大分子封装纳米粒子（包括硫化铜、铂和一个具有5nm尺寸的钯纳米颗粒）显示出优异的光热性能。利用TAT或RGD多肽对其进行改性促进细胞摄取能力和实现肿瘤靶向给药。使用荧光探针修饰以实现实时成像和跟踪粒子分布。该研究表明RGD修饰的DENPs在近红外线照射下能有效地抑制肿瘤生长。

【解读】

光热治疗（PTT）是一种很有前途的癌症治疗模式。为了进行高效的PTT，在过去十年中已开发出多种光热剂（PAs），包括金属纳米粒子、碳基材料、半导体纳米颗粒和有纳米结构的聚合物。这些PAs均表现出优良的光热效应和彻底的灭活肿瘤能力，但由于颗粒尺寸相对较大、多功能化难以实现等问题，它们很少被用于临床。

颗粒大小显著影响了PAs在体内的药物学行为。PAs在一维上的尺寸一般大于40nm，难以深入肿瘤组织且难以被清除出体外，从而降低了治疗效果并增加了潜在的毒性。但这个问题可以通过减小粒径来解决。

据证实，小于10nm的纳米颗粒可以渗透到肿瘤的更深区域，与较大粒径尺寸的颗粒相比，更容易有效地被肿瘤细胞内化，也可以快速清理出体内。同时，超小的体积也使它们能够逃脱网状内皮系统的捕获（例如，肝，脾），以提高它们在肿瘤细胞中的积累。

多功能化赋予PAs很多附加功能，包括诊断、成像、靶向给药、跟踪粒子的药物学行为和评估治疗效果。鉴于上述优势，多功能纳米粒子在个性化治疗中很有发展前景。

然而，高质量多功能化仍是一个巨大的挑战。多功能意味着附加成本增大和多合成步骤增多，特别是对于超小纳米颗粒，在它们的表面很难排列不同的功能团。因此，合成的多功能纳米粒子可能具有不理想的药物动力学行为并在体内引起严重的不良反应。

树形聚合物具有良好的形状尺寸、中空的内部和高密度分布的表面功能团，使其可作为模板合成具有高单分散性和稳定性的超小纳米颗粒（通常<5nm）。本研究首先使用树形聚合物合成超小的光热剂（UPAs），包括硫化铜（CuS）、铂（Pt）和钯（Pd）纳米颗粒，然后用多功能基团改性它们。

树形大分子封装铂纳米粒子（DEPt）后具有优异的光热效应和良好的生物相容性，成为性能最优的UPA。DEPt进一步用不同肿瘤靶向肽修饰（即反式转录激活因子（TAT）和环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽），分别得到TAT-DEPt和RGD-DEPt。

使用荧光探针追踪了细胞内TAT-DEPt和RGD-DEPt的传递，并在近红外波段照射下（NIR）对它们的体外细胞杀伤功效进行了测定。深入研究它们的肿瘤靶向效率和灭活肿瘤的能力。

【制备方法】

1. G5-NH2聚酞胺-胺型树形高聚物的合成

将G5-NH2树形高聚物（200mg，0.007mmol）溶解于3ml无水甲醇，再加入三乙胺（127μL，0.911mmol）和乙酸酐（69μL，0.728mmol）。将该混合物在室温下搅拌48小时，然后转移到透析袋中，用去离子水透析10次。

2. 树形封装金属纳米粒子的合成

DECuS是通过共沉淀法制备的。首先，将0.354ml的CuCl2（100mM）加入到1.700mL的G5-NH2-AC100（0.163mmol）水溶液中，在室温磁性搅拌条件下逐滴加入0.884ml的NaHS（80mM），随后颜色立即从浅蓝色变为深褐色。

30min后，将反应溶液转移到油浴中并在90℃加热15分钟。最后，得到暗绿色溶液。在室温下冷却后，将反应溶液转移到透析袋中用去离子水透析。收集最终产物并在4℃下保存。

标准的DEPt合成步骤是：使用磁力搅拌，在0.150mLG5-NH2-AC100水溶液（0.573mM）中加入0.553Ml的K2PtCl6（20 mM）。 24小时后，在反应溶液中加入0.553mL的NaBH4（200 mM）溶液。2h后，将反应溶液转移到透析袋，并用去离子水透析。收集最终产物并在4℃下保存。

3. TAT或RGD修饰的树形聚合物的合成

G5-NH2AC100（37.00mg，1.117μmol）分散在3.0mL含有3mM EDTA·2Na溶液（pH 7.2）的PBS缓冲液中。将溶解于DMSO溶液中的SMCC（2.24mg，7μmol）加入上述溶液中，然后将反应溶液在室温下搅拌24h。

将TAT（13.93mg，8μmol）或RGD（4.85mg，8μmol）加入到反应溶液中，并将混合物在室温下搅拌24h。将该溶液装入透析袋用去离子水透析以除去游离的肽。

4. TAT树形RBITC和RGD树形RBITC的制备

通过在TAT-树形聚合物溶液中（1.10μM）加入RBITC（5.50μM）制备TAT-树形大分子RBITC。该混合物在室温，黑暗环境中搅拌24h。未反应的RBITC通过多次去离子水透析除去。RGD-树形大分子-RBITC通过相同方法制备。

5. TAT-DEPt和RGD-DEPt的制备

TAT-DEPt 和 RGD-DEPt的制备与DEPt的合成方法相似。将0.553mLK2PtCl6（20mM）加入到0.150mLTAT-树状物或RGD-树状物（0.573mM）中。

24h后，将0.553mL的NaBH4（200 mM）溶液加入到该反应溶液搅拌2h。然后将反应溶液转移到一个透析袋，并用去离子水透析。收集最终产物并在4℃下保存。。

6. RGD-DEPt-Cy5.5的制备

通过在去离子水中混合0.005mLCy5.5 N-羟基琥珀酰亚胺酯(0.7mM)和0.15mL RGD-DEPT（0.7 mM），在黑暗环境下反应24小时获得RGD-DEPT-Cy5.5。

【结果简析】

1. 表征

图1  多功能UPAs的制备示意图

乙酰化的树形大分子先封装纳米粒子（包括硫化铜、铂和钯纳米颗粒），再表面改性处理，最终得到具有超小尺寸、多功能且高稳定性的UPAs。

图2  DECuS、DEPt、DEPd的TEM图像

该插图显示单DENP的高分辨透射电子显微镜图像。用共沉淀法制备了树状大分子封装纳米CuO（DECuS）。

该透射电子显微镜（TEM）图像示出DECuS有4.5±3.0nm的平均超小尺寸，0.33nm的晶格条纹，这与六角CuS的（102）面一致。DEPt有1.4±0.3nm的超小型尺寸，DEPd的尺寸为1.5±0.5nm。

高分辨透射电子显微镜图像显示，DEPt和DEPd的晶格条纹分别为0.22和0.21nm。

2. DENPs的光热效率

图3  悬浮于去离子水（300µM，1mL）中的DENPs的温度变化

去离子水和树形聚合物溶液用作对照。通过暴露在NIR光下，DECuS、DEPt和DEPd悬浮物的温度迅速提高到一个很高值，分别为45.6、47.0和43.8℃，而去离子水和树形聚合物溶液显示增强最小。结果表明，DENPs能高效地将NIR光转化为热能。

3. 细胞毒性

NIH3T3和PC-9细胞接种在96孔板中，实验前一天，每个孔的密度为10000个细胞。细胞用PBS洗涤一次，然后在37℃下与DENPs一起培养在浓度范围为0-400µM的孔板中24小时。（相当于树形聚合物的浓度范围是0-3.906µM）

图4  三种DENPs在NIH3T3细胞中的细胞毒性

通过对NIH3T3的正常细胞系和PC-9的癌细胞系使用标准的3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5-二苯基溴化物（MTT）法对DENPs的细胞毒性作用进行评估。结果表明，DEPt和DEPd在0-400µm的浓度范围内对两种细胞系的毒性可忽略，而DECuS在高浓度时是有毒的。

4. 使用DEPt光热杀伤肿瘤细胞

PC-9细胞接种在96孔板中，实验前一天，每个孔的密度为10000个细胞。将细胞与DEPt在37℃，200μM的浓度下培育4小时（相当于树形聚合物的浓度1.953μM，光密度为808nm（OD808）=0.225），然后在功率密度为6.4 W·cm−2的808nm的近红外激光照射10分钟。

此外，激光功率密度和照射时间是变化的，以评估癌症杀伤效率。 NIR治疗后，再将细胞在37℃培养2小时，然后用标准MTT法进行分析。 为了使用AO / EB双重染色法，将细胞在近红外辐射后用冷PBS洗涤两次，然后用AO（5μg/mL）和EB（5μg/mL）染色处理3分钟。在此之后，将细胞再用冷PBS洗涤两次并用荧光显微镜观察。

5. 体外细胞摄取TAT树形RBITC和RGD树形RBITC

图5 TAT肽增强细胞摄取DEPt。 TAT媒介细胞摄取DEPt示意图

图 6 RGD肽增强部的细胞摄取DEPt RGD媒介细胞摄取DEPt的示意图

TAT肽可以穿透细胞膜，促进细胞对不同药物的摄取，在G5-NH2聚酞胺-胺型树形高聚物上修改2.5 TAT肽的平均数目，荧光探针和罗丹明B异硫氰酸酯（BITC）被进一步修饰在TAT-树形聚合物上，用于原位监控（TAT-树状RBITC）。

图 7  RBITC发出红色的荧光。肌动蛋白丝被鬼笔环肽-FITC（绿色）染色，细胞核被DAPI（蓝色）染色

NIH3T3细胞和PC-9细胞分别用TAT-树状RBITC和树形大分子RBITC处理。经过4小时的温育，仅TAT-树状RBITC被被两种细胞更有效地吸收。

6. 通过ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）分析体外细胞摄取TAT-DEPt和 RGD-DEPt

图 8  测定PC-9细胞中Pt的含量

用树形TAT制备TAT-DEPt，它有类似于DEPt的大小和光热效应。PC-9细胞用TAT-DEPt和DEPt处理，细胞内的Pt含量通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定。结果显示，被TAT-DEPt处理的细胞中铂含量比被DEPt处理的细胞的高得多。

7. 使用TAT-DEPt或RGD-DEPt光热杀死肿瘤细胞

图 9 PC-9细胞在NIR照射后AO / EB双重染色结果

光热杀伤实验表明，在近红外照射前去除自由的TAT-DEPt。用TAT-DEPt处理的PC-9细胞在照射区域全部被杀死（如上图右，有白色虚线圆标志），而用DEPt处理的细胞表现出可以忽略不计的细胞死亡（如上图，左）。

这些研究证实了TAT肽可以提高细胞摄取DEPt的能力，导致体外更有效的光热杀死癌细胞。

8. 体内光热灭活肿瘤

图 10    PTT治疗后切除肿瘤，肿瘤的形貌和重量

肿瘤组织中RGD-DEPT组（RGD+）铂的含量均显著增加，但在肝和脾12h和24h两个时间点处RGD-DEPT组（RGD+）铂的含量与DEPT组（RGD-）相比降低了。上述分析证明RGD可以有效地提高靶向递送DEPt到肿瘤的能力。

图 11  通过原位末端标记测定治疗后凋亡的肿瘤细胞（红色）

上图表明，RGD-DEPT可有效积累在肿瘤并实现高效的PTT。

【总结】

DENPs衍生的UPAs包括DECuS、DEPt和DEPd，具有尺寸超小，单分散性好、稳定性和光热转换效率高等优点。得益于树形聚合物表面上的高密度的功能团，DENPs可以被不同的功能团修饰，如细胞穿膜肽、肿瘤靶向肽和荧光探针，它们的数量和位置可控制。

程义云教授等人的研究将树状大分子与超小型纳米粒子合成和精确表面改性的优点相结合，提供了为剪裁PTTs制备多样化UPAs的一个简易路线。

【程义云教授简介】

2004年本科毕业于中国科技大学高分子科学与工程专业，之后开始在中国科学技术大学进行硕博连读，并于2008年获得中国科学技术大学结构生物学专业理学博士学位。之后在美国圣路易斯华盛顿大学（Washington University in St. Louis) 做博士后。2010年受聘于华东师范大学生命科学学院生物医学工程专业教授，同年8月被聘为博士生导师。

一直致力于树枝形分子等纳米生物材料的研究工作‚已经在Nature Materials‚ Chemical Society Reviews, Journal of the American Chemical Society‚ Journal of Physical Chemistry B等国际知名刊物发表第一作者/通讯作者SCI论文30多篇‚论文影响因子总和达160‚ 被制药科学和药物化学领域知名刊物Chemical Society Reviews, Frontiers in Bioscience‚ Journal of Pharmaceutical Sciences‚ European Journal of Medicinal Chemistry等邀请撰写专题综述6篇‚ 所发表第一/通讯作者论文已有7篇（次）被杂志选为出版当年、当季度的热门或引用次数最多的文章。

【备注】

该研究成果近期发表在ACS Nano (IF: 12.881)上，文献链接：Dendrimer-Templated Ultrasmall and Multifunctional Photothermal Agents for Efficient Tumor Ablation

本文由材料人生物材料学习小组年轻的疯狂者供稿，材料牛编辑整理。

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