学术干货│荧光光谱入门(二)：荧光光谱仪和荧光分析新技术

一、荧光光谱仪

1. 荧光光谱仪结构

荧光光谱仪(荧光分光光度计)是测量荧光的仪器，主要由光源、激发单色器、样品池、发射单色器和检测器等组成。

图1 荧光光谱仪及其主要组件示意图

(1)光源

由于荧光样品的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作为一种理想的激发光源应具备：足够的强度、在所需光谱范围内有连续的光谱、强度与波长无关(即光源的输出是连续平滑等强度的辐射)、稳定的光强。常用的光源主要有氙灯和激光器。

(2)单色器

荧光光谱仪中单色器一般为光栅或滤光片，需要两个，一个用于选择激发光波长(激发单色器)，一个用于分离选择荧光发射波长(发射单色器)。

(3)样品池

荧光光谱仪用的样品池材料要求无荧光发射，通常为熔融石英，样品池四壁均光洁透明。对于固体样品，通常固定在样品夹的表面。

(4)检测器

荧光的强度通常比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。一般采用光电倍增管(PMT)，二极管阵列检测器、电荷耦合装置以及光子计数器等高功能检测器也已得到应用。

2. 荧光光谱仪的光谱分辨率

光谱分辨率是指把光谱特征、谱带分解成为分离成分的能力。分析人员需要什么样的光谱分辨率取决于所面对的具体问题。一般，用于基本样品识别的常规分析只需要低/中光谱分辨率。对于样品峰位移动或受外在环境因素影响而引起峰位移动的表征则通常需要高分辨率，因为这些现象在荧光光谱上仅仅表现为非常细微的变化，在低分辨率实验中观察不到。

3. 荧光光谱仪中的单光子计数技术

单光子计数技术是利用在弱光下PMT输出信号自然离散化的特点，采用放大技术和精密的脉冲幅度甄别技术以及数字计数技术，可把淹没在北京噪声中的荧光信号提取出来。当荧光到达PMT的光电子阴极时，每个入射光子以一定的概率(即量子效率)使光阴极发射一个电子。这个光电子经倍增系统的倍增最后在阳极回路中形成一个电流脉冲，通过负载电阻形成一个脉冲电压，这个脉冲称为单光子脉冲，而“单光子计数技术”可以测得低至单个不重叠的光子能量脉冲，通过精密的鉴别手段进行工作，从而实现探测“单光子”级别微弱信号的目的。

4. 荧光光谱仪中的波长准确度和波长重复性

波长准确度，是指波长的实际测定值与理论值(真值)的差。荧光光谱仪的波长准确度是很重要的技术指标，特别是对不同仪器的测定结果进行比较时，波长准确度尤其重要。例如，要对比两台荧光光谱仪对同一样品的分析测试结果，如果仪器的波长准确度不好，就无法进行比较或比较不出正确的结果。针对同一物质，在不同波长测试同一物质时，用于不同波长时的荧光性质不同，就会有不同的灵敏度，即使同一样品，测试的数据也会不同。用一台荧光光谱仪做定量分析时，若仪器的波长准确度不好，也会因仪器的波长误差，而产生很大的分析误差。波长准确度对国家的计量法执法非常重要。

波长重复性与波长准确度一样重要。如果一台荧光光谱仪的波长重复性不好，就等于每次分析测试时所用的波长都是不同的，不可能得到可靠的分析结果。因此，一台仪器的波长重复性不好，就无法满足使用要求。

5. 荧光光谱仪中的信噪比(S/N)

荧光光谱仪中常用水的拉曼作信噪比测试，这是比较不同仪器之间灵敏度的一个好方法。虽然有很多有效的方法可以获得信噪比数据，但是给出的数值却不同。为了进行对比，不仅要知道怎么测量水拉曼S/N值，还要知道怎么处理数据。

一般水的拉曼S/N测试方法是把体系的灵敏度(信号存在)和体系噪音(信号不存在)的数据同时获取并进行比较，显示了仪器的综合性能。

对于S/N值的处理，一种是将其定义为水拉曼峰信号和背景信号的差值和背景信号平方根的比值(Peak-Peak方式)：

另一种是峰信号和背景信号的差值除以在背景信号上噪音的有效值(RMS信噪比方式)，有效值的取值可以是该点处动态扫描测量值除以5：

6. 荧光光谱仪的灵敏度影响因素

光源、检测器暗电流，光谱仪设计造成的光学噪声等因素都会影响灵敏度。

7. 荧光光谱仪的选择

目前，荧光光谱仪根据特定的应用领域都附加有不同的特长。可以从灵敏度、光谱采集速度、模块化、自动化、多功能性、独特性、实际环境性能，以及升级需求等方面考虑选择合适的荧光光谱仪。当然，也可以联系生产厂商，提出应用需求，进行个性化定制。

二、荧光分析新技术

常规的荧光分析技术主要是直接或间接对无机化合物、有机化合物等进行定性和定量分析，因其高灵敏度和选择性，得到了较为广泛的应用。然而，在实际情况中由于分析物质的复杂性、所处环境的多样性等，常规的荧光分析法收到了极大限制。许多新型的荧光技术，例如同步荧光分析、偏振荧光分析、三维荧光分析、时间分辨荧光分析、低温荧光分析、单分子荧光分析、荧光免疫分析等，得到了迅速发展，在特定的领域显示出了更高的灵敏度和更强大的功能。下面选择几种进行简单介绍：

1. 同步荧光分析

同步荧光分析由Lloyd首先提出，它与常用荧光测定最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图，即同步荧光光谱。按光谱扫描方式的不同，同步荧光分析可以分为恒(固定)波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。同步荧光分析具有光谱简单，谱带窄、分辨率高、光谱重叠少等优点，可提高选择性，减少散射光等的影响，非常适合多组分混合物的分析，在环境、药物、临床、化工等领域应用广泛。

图2 某池塘水样的恒波长同步荧光光谱

2. 偏振荧光分析

任何物质都处于不断运动中，液体环境中的荧光分子也不例外。因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态(如旋转或翻转)、荧光分子与其他因子相互作用(如相互结合或排斥)、其所处环境的性质(如溶液的黏度、温度_等因素都可能对荧光分子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。对此进行分析比较，就可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的。荧光体的荧光偏振与荧光各向异性值的测定，能够提供与荧光体在激发态寿命期间动力学相关的信息，因此荧光偏振技术被广泛应用于研究分子间的作用，例如蛋白质与核酸、抗原与抗体、蛋白质与多肽的结合作用等。

荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势(特别是不生成有害的放射性废物)，并且检测限更低，可达到亚纳摩尔级范围。此外，荧光偏振是真正均相的，允许实时监测(动力学监测)，对浓度变化不敏感，是均相检测形式的最佳解决方案。

图3 不同体积比全血溶液的荧光偏振光谱

3. 三维荧光分析

三维荧光光谱是近几十年中发展起来的一种新荧光技术。普通荧光分析所得的光谱是二维谱图，包括固定激发波长而扫描发射波长所获得的发射光谱，和固定发射波长而扫描激发波长所获得的激发光谱。但是实际上荧光强度应该是激发和发射这两个波长变量的函数。描述荧光强度同时随激发和发射波长变化的关系谱图，就是三维荧光光谱。它可以提供比常规荧光光谱和同步荧光光谱更为完整的光谱信息，是很有价值的光谱指纹技术。在一个多组分体系的三维荧光光谱中，每种组分有独立吸收和发射的特定光谱区，可以通过一次扫描便有可能检测体系中的全部组分。

三维荧光光谱可以作为光谱指纹技术在环境监测(溶解有机质的分布等)、临床化学(根据癌细胞荧光代谢产物的检测，区分癌与非癌细胞等)以及细菌鉴别等领域应用；也可用于光化学反应监测、多组分混合物的定性和定量分析等。

图4 三峡水库中溶解有机质的三维荧光光谱图

4. 时间分辨荧光分析

由于不同分子的荧光寿命不同，可在激发与检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质得以分别检测，即时间分辨荧光分析。采用带时间延迟设备的脉冲光源和带有门控时间电路的检测器件，可以在固定延迟时间后和门控宽度内得到时间分辨荧光光谱。选择合适的延迟时间，可以把待测组分的荧光和其他组分或杂质的荧光以及仪器的噪声分开不受干扰。采用激光光源可以获得皮秒(ps)级的脉冲宽度，可用于测定大多数荧光物质的寿命，非常有助于生物大分子和基团作用的研究。该技术与荧光免疫分析结合形成了时间分辨荧光免疫分析法。

5. 低温荧光分析

通常荧光分析都在室温下进行，荧光光谱为带光谱，由于各种变宽因素，谱带往往较宽。自然界有许多有机化合物，其化学结构颇为接近，而且各存在着多种同分异构体和衍生物，它们的光谱往往相互重叠，难以鉴别表征以及定量测定。环境因素对分子荧光会产生显著的影响，温度是其中一个主要因素。随着温度的降低，介质黏度增大，荧光分子量子产率和荧光强度将增大。因此，在低温以及特殊条件下，荧光物质就能给出尖锐的荧光光谱(“准线性光谱”)，这就有可能对样品中所含荧光体进行“指纹识别”，甚至有可能对混合物中某些特定组分进行定量测定。

低温荧光分析法基本可以分为四种类型：冷冻溶液Shpol’skii荧光法、蒸气相基体隔离荧光法、基体隔离Shpol’skii荧光法、有机玻璃中荧光窄线法。低温荧光分析可用于多环芳烃及衍生物的鉴别与定量、DNA加合物的分析等。

图5 羊茅草叶绿素的常温和液氮低温下的荧光光谱

6. 单分子荧光检测

单分子检测被称为分析化学的极限，近年来取得了重要进展。其中，单分子荧光分析是实现单分子检测最灵敏的光分析技术。单分子荧光检测的关键在于确保被照射的体积中只有一个分子与激光发生作用以及消除杂质荧光的背景干扰。通常采用高效滤光片，利用共焦、近场合消失波激发，可以达到此目的。单分子荧光检测可提供单分子水平上生物分子反应的动力学信息，分子构象以及构象随时间的变化，因此尤其在生命科学领域中具有广阔的应用前景，为生命科学提供了新的研究手段。

7. 荧光免疫分析

免疫分析是基于蛋白抗原和抗体之间、或者小分子半抗原与抗体之间的特异反应的分析方法，是生物分析化学的重要内容之一。其中，用荧光物质作为标记的免疫分析即为荧光免疫分析。作为荧光标记物，应具有高的荧光强度，其发射的荧光与背景荧光有明显区别；它与抗原或抗体的结合不破坏其免疫活性，标记过程要简单、快速；水溶性好；所形成的免疫复合物耐储存。常用的荧光物质有荧光素、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰基荧光素等。荧光免疫分析主要应用于生物医学领域，并向着超高灵敏度和操作自动化的方向发展。

参考文献：

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本文由材料人编辑部纳米学术组Roay供稿，材料牛编辑整理。

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