施剑林课题组Chem.Rev.最新综述: 用于成像和治疗肿瘤缺氧的功能化探针的化学设计和合成

【引言】

肿瘤中的缺氧发育与其侵袭性和强烈的治疗抗性密切相关，这会导致几种类型的癌症预后不良。临床上常常使用侵入性氧微电极和高剂量放射线来准确检测和有效地对抗缺氧。但是最近出现了旨在开发可用于非侵入性成像和有效治疗缺氧性肿瘤的功能分子和纳米材料的跨学科研究。

近日，来自上海硅酸盐所的施剑林研究员和刘佳男助理研究员以及上海硅酸盐所研究员、华东师范大学教授步文博（共同通讯）概述了迄今为止发布的关于缺氧性肿瘤成像和治疗的报告。首先，以荧光成像、正电子发射断层扫描、磁共振成像和光声成像的顺序，介绍了可以非侵入式应用于图像缺氧的各种缺氧反应探针的设计理念。总结了可用于有效治疗肿瘤缺氧的最新功能纳米材料，最后还讨论了该领域研究人员面临的挑战和未来前景。上述内容以“Chemical Design and Synthesis of Functionalized Probes for Imaging and Treating Tumor Hypoxia”为题发表在了Chemical Reviews上。

综述导览图

1 简介

当肿瘤以过大的方式生长时，肿瘤的内部的血液供应远远不足，导致氧气（O₂）的输送被大大抑制。这种不足的氧气供应几乎不能满足积极增殖的肿瘤细胞不断增加的代谢需求，使得瘤内微环境显著缺氧。因此，缺氧是所有实体瘤的常见特征。在过去二十年中，相当多的研究已经证明，缺氧性肿瘤患者生存率显著降低。

为了对抗缺氧，需要有效的方法来可靠地检测甚至成像肿瘤缺氧。准确的缺氧成像将使临床医生不仅能够找到那些缺氧的荷瘤患者，并且定位缺氧，还可以制定合适的治疗策略，从而有助于治疗结果的改善。临床上，O₂针电极法通过将细针电极插入容易获得的肿瘤部位作为标准，使得研究者能够定量地进行局部O₂浓度的精确测量以及找出几个特定的轨迹。而且，更有利的是，可以采用非侵入性方法来精确地映射目标区域的缺氧异质分布。

2 低氧敏感荧光探针

2.1 感应氧化还原状态

据报道，低氧微环境中的低O₂浓度可能会引发各种还原物质如黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的积累。这些物质将导致剩余O₂的减少，从而产生过量的活性氧（ROS）。另外，由于正常的肿瘤细胞进行有氧糖酵解，因此常常产生来自葡萄糖的乳酸，而低氧性肿瘤中的缺氧会诱导细胞中的厌氧糖酵解作用。这个过程将导致乳酸和酸中毒的产生增加，导致酸性细胞外微环境（pH值：6.5-6.9）。结果，缺氧微环境具有增强的氧化还原、ROS和酸中毒的水平。

通常，缺氧程度与还原物质如硝基还原酶（NTR）和偶氮还原酶的局部浓度密切相关。因此，基于这些衍生物缺氧引发的分子切割特性，通过使用硝基芳族化合物，醌或偶氮苯（偶氮）衍生物作为缺氧敏感部分已经开发了许多光学探针。这些缺氧敏感探针通常是基于荧光共振能量转移（FRET）构建的，其中FRET供体和FRET受体通过缺氧可裂解基团连接在一起。因此，可以采用分别在缺氧和正常情况下的FRET开关状态来反映缺氧程度。

图1 用硝酸还原酶活化的探针的催化发光示意图

图2 NADH还原探针的示意图

图3 基于偶氮探针的检测机理和化学结构

2.2  氧分子感测

通过开发含有氧化还原敏感性基团的缺氧探针，理论上可以监测缺氧程度。然而，当涉及具体应用时，由于它们不直接测量细胞pO₂，所以这些策略可能会受到其他氧化还原物质（如谷胱甘肽和半胱氨酸广泛存在于癌细胞中）的很大影响。因此，开发低氧敏感性探针更为重要，可以将临床相关区域（0-15 mmHg）内的pO₂值直接显示，甚至可以在体外和体内准确地描绘O₂分布。

幸运的是，长期以来已经探索了可以被O₂分子淬灭的发光探针。光致发光的O₂敏感分子通常基于具有较长衰变辐射和寿命的染料，例如Ru²⁺络合物，Ir²⁺络合物和最近开发的基于卟啉的化合物，在光照射下，通过内部转换和系统间交叉过程，指示器迅速放松至激发三重态。一旦与O₂分子接触，激发的染料分子的一部分将通过与O₂分子的碰撞相互作用而淬灭，因为来自三线态的发射强度通常较低。结果，随着氧浓度的增加，磷光的产率将随着浓度依赖性的增加而降低。这种O₂诱导的磷光猝灭效应可用于O₂的直接和可逆感测。

图4 在O₂诱导的磷光猝灭过程中主要能量转换途径的示意图

通过利用这些O₂指示器，已经有许多基于单磷光发射强度变化的“ON-OFF”检测开关的光学探针。尽管有吸引力，基于单个强度的报告信号并基于个体使用一个O₂敏感染料在实际应用中容易受到探针浓度、光散射和外部环境变化（如温度或pH值）的干扰。 由于O₂浓度和荧光强度之间的实际关系总是不是线性的，没有复杂数据处理的帮助，准确和定量地确定O₂浓度是非常困难的。

在过去十年中，研究人员已经开发出至少三种策略来克服上述缺点。一个有效的策略是依赖于复合探针的开发，该复合探针包含O₂非敏感染料和O₂敏感指示剂。这样的探针可以通过同时记录两个波长的荧光强度来实现O₂浓度的测量，从而通过将强度比与O₂浓度相关联来提供对环境影响的校正机会。检测的一种更有效的方法是开发基于FRET的双发射纳米探针。通常，这些纳米探针由荧光染料/纳米颗粒组成，既作为FRET供体和荧光参照，又是O₂敏感的有机染料并用作发射感应信号的受体。预计供体的相对短波长的发射将激活受体以发射更长的波长，因此这两个发射之间的比例可以通过O₂浓度来调节。第三种是磷光寿命成像，作为荧光团的固有特性，磷光寿命只能通过O₂浓度改变。因此，这种寿命信号不会受到细胞、器官或甚至体内发光分子的异质分布的影响。

图5 通过开发量子点装饰膜的光学O₂探头的示意图

图6 用于比例测量活细胞中O₂浓度的分子探针的设计概念

2.3 同时感测氧气和pH值

上述探针只能报告一种缺氧相关参数。然而，缺氧的物理和化学行为通常不仅仅由一个环境因素决定，是由两个或更多个因素（如O₂浓度和pH）的相互影响在一起决定的。尽管缺氧与低氧浓度和酸中毒密切相关，但细胞外pH值和O₂浓度之间缺乏明确的空间相关性。为了更准确地阐明缺氧微环境，有必要探索能够同时检测多个环境参数的多功能荧光探针。

为了提供O₂浓度和pH值的精确测量，当将O₂和pH指示剂组合到一个系统中时，开发具有可分离发射波长的高通量发光探针是很好的选择。从应用的角度来看，探针中的两个荧光部分必须由单个光源激发。因此，它们的吸收光谱必须在一定程度上彼此重叠，而来自探针的两个发射可以在空间上彼此分离，但不经历FRET。矛盾的是，气体传感器通常因为它们的气体透过性由疏水材料制成，而亲水性材料需要感测pH。 因此，用于细胞内应用的这种多种纳米探针的设计和构建是非常具有挑战性的，以满足对各个参数的独特感测同时的多方面要求。

该问题的第一个解决方案是将两个微粒与不同的渗透选择性结合起来，以同时检测酸度值和O₂水平。在该系统中，pH指示剂羧基荧光素被包封在由可渗透的聚甲基丙烯酸羟乙酯制成的颗粒中，而O₂指示剂钌（II）络合物物理吸附在溶胶-凝胶基粒中。之后，将这两种微粒分散在由水凝胶制成的基质中，最终同时允许光学检测pH和O₂。

作为另一种解决方案，Wolfbeis等人 开发了基于聚合物的纳米探针，高度生物相容的聚合物Pluronic F-127芯与聚乙二醇（PEG）连接以形成纳米探针。铂（II）内消旋-四苯基四苯并卟啉（PtTPTBP）作为亲油性O₂敏感探针和五氟苯基卟啉（TFPP）同时包封在疏水核心。此外，pH敏感探针、发绿色荧光素异硫氰酸酯（FITC）与位于壳上的PEG基团共价连接。 Pt-TPFPP的红色发光强度随着pO₂的增加而降低，同时FITC的绿色荧光随pH值的增加而增强。

图7 O₂和酸性双纳米探针的化学结构示意图

3 低氧敏感PET探针

虽然光学成像具有单细胞灵敏度的优点，但随着成像深度的增加，其空间分辨率迅速下降。在临床可用的成像方法中，MRI、计算机断层扫描（CT）、PET和单光子发射断层扫描（SPECT）由于其组织深度的独立性而非常有吸引力。其中，通过在放射性示踪剂探针的帮助下，通过提供无创和3D评估肿瘤缺氧程度。通常，缺氧标记应该能够容易地和非特异性地进入癌细胞，仅在缺氧细胞中停留，而不在常氧细胞中。

通常，PET放射性示踪剂由放射性同位素和对缺氧微环境特异性的缺氧反应性分子组成（例如由代谢产生的还原或葡萄糖）。Cu，¹⁸F，¹¹C和¹⁵O经常被选为放射性同位素，因为它们探针的低氧反应性部分可以分为两组：硝基咪唑类似物和非硝基咪唑试剂。

3.1 硝基咪唑类似物

2-硝基咪唑类化合物被认为是PET缺氧成像的第一代分子探针。硝基咪唑可被动地扩散到肿瘤细胞中，随后在正常氧条件下进行还原反应以形成中间产物，这些物质可以快速再氧化成母体化合物，导致细胞扩散。在缺氧条件下，硝基离子基团将继续经历生物还原过程，导致亚硝基杂环的持续产生,这种产生的物种最终将被捕获在细胞中。

图8 在缺氧条件下捕获的硝基咪唑的机理示意图

3.2 非硝基咪唑试剂

作为最常用的PET显像剂，2-氟-2- [¹⁸F]脱氧-D-葡萄糖（[¹⁸F] FDG）已成功用于缺氧检测。FDG PET缺氧成像的原理是基于葡萄糖代谢，利用肿瘤中上调的葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶，众所周知的是Warburg效应。在缺氧条件下，线粒体中合成的ATP的量将减少，导致细胞糖酵解的刺激来补偿能量供应。因为肿瘤的[¹⁸F] FDG摄取量与缺氧程度直接相关，所以FDG-PET被用作肿瘤缺氧标记物。然而，FDG保留与肿瘤缺氧程度之间的不准确相关性已经在许多临床研究中被发现，因为大多数非低氧性肿瘤细胞也严重依赖于糖酵解ATP产生。因此，FDG作为特异性缺氧示踪剂的潜在应用似乎受到限制。

图9 缺氧诱导的⁶⁴Cu-ATSM形成用于PET成像的示意图

图10 ¹⁸F-FAZA辅助PET图像用于剂量绘图

4 低氧敏感性MRI探针

4.1 T₂-MRI探针

迄今为止，还没有关于缺氧敏感的T₂-MRI造影剂的报道，因为目前的超顺磁性药物的T₂-MR效应通常与缺氧微环境无关。幸运的是，血氧水平依赖性MRI（BOLD-MRI ）作为缺氧检测方法能够使用梯度回波序列跟踪血氧饱和度。该方法的原理是基于以下事实： 由于血液中脱氧血红蛋白含量的变化会改变水的松弛行为（特别是T₂ *），血红素亚基内的铁离子的状态将从高pO₂处的抗磁性低自旋状态变为顺磁性，可以通过MRI测量血氧饱和度水平。在过去几十年中，一些研究已经证明，BOLD效应与测量pO₂的标准呈现出密切的相关性。最近的报告也提出了BOLD-MRI技术对患者缺氧成像的可行性，其提供监测氧合波动的能力显示出几个优点，包括其无创性和对氧合水平变化的实时检测。

4.2 T₁-MRI探针

虽然基于T₂-MRI的这些策略能够将缺氧与常氧区分开，但由于BOLD和T₂-MRI影响与组织氧合不直接相关，因此它们仍然无法提供pO₂的定量测量。更糟糕的是，基于T₂-MRI的测量通过减少水的横向自旋弛豫时间使信号减少。这种信号变弱效应可能与其他致病过程混淆，使得检测结果不太可靠。幸运的是，与T₂ */T₂加权图像相比，T₁加权序列能够提供更高分辨率和信噪比的图像，因为它们通过减少纵向自旋晶格弛豫时间使得有关地区似乎“更亮”。

 图11 缺氧敏感探针的设计策略

图12 MRI Gd-DOTP测绘实验程序示意图

4.3 ¹⁹F MRI探针

如上所述，常规临床MRI检测¹H核的信号，其大部分位于人体内的水和脂肪中，其他活性核，如¹³C，¹⁹F，²³Na和¹²⁹Xe也可用于MRI检测。其中¹⁹F MRI最近受到极大的关注，因为它具有与¹H相似的NMR灵敏度（83％的相似度），并且在¹H附近提供了最高的灵敏度。更重要的是，组织中的内源性¹⁹F浓度通常小于10^-3μmol/ g，一般低于检测限¹⁹F MRI。 身体组织中缺乏背景信号使¹⁹F MRI具有较高的信噪比，在检测到¹⁹F信号时，具有更高的特异性。

 图13 两个氟化氧化还原活性铜络合物的示意图

4.4 PARACEST探针

到目前为止，MRI可检测的缺氧探针主要限于T₁松弛剂，这些一直被过度利用以达到所需的检测灵敏度。在过去十年中，已经发现了一类新的具有高灵敏度的基于CEST的造影剂。为了使CEST发生，两个池之间的质子交换率（k_ex）应该小于两个池之间的化学位移差（Δω）。考虑到这个标准，用于增加Δω值的各种不稳定的含质子的配体如-SH、-OH和-NH已经与顺磁镧系元素或过渡金属络合物结合形成大多数PARACEST试剂。由于这种金属离子的顺磁效应，这些质子的¹H NMR信号显示出非常大的化学位移，这取决于金属离子和含质子配体之间的距离和几何取向。

 图14 Co²⁺/Co³⁺络合物和CEST光谱的结构

4.5 低氧敏感双模成像探针

虽然上述开发的针对缺氧的探针在未来的临床应用中具有很大的潜力，但是由于探针浓度的波动引起的可能的假阳性对比，所以响应于缺氧的信号强度变化可能不会百分之百可靠。如果一个成像探针可以同时报告两种成像模式的缺氧程度，则可以实现比单一成像模式更有说服力和准确的缺氧评估。特别地，能够解剖和功能成像的双模显像剂将为缺氧的可靠临床诊断提供强大的和互补的信息。

图15 缺氧检测通过MRI /荧光双峰成像

5 低氧敏感光声探针

光学成像能够在生物组织中提供丰富的对比度，但遭受严重的光散射，从而导致不可避免的缺点，例如有限的组织穿透深度和严重的光学散焦。单个成像可以具有足够的空间分辨率和较少限制的穿透深度。幸运的是，通过将激发的光子转化为超声能量，光声层析成像（PAT）具有高穿透深度（几厘米）和高空间分辨率的优点。吸收光子后，生物分子可以通过所谓的光声效应，检测到这种诱发的压力波形成的PAT图像。结果，PAT继承了高超声波分辨率和丰富的光学对比度的优点，但缓解了自身的缺点，使得解剖和功能成像同时成为可能。

图16 PAT成像机理原理图

6 治疗肿瘤缺氧的治疗剂

通常，大多数目前可用的治疗策略，包括化学疗法、RT和光动力疗法（PDT），由于其独特的微环境，在治疗缺氧性肿瘤方面仅仅取得了有限的成功。令人不安的是，实体瘤中存在的缺氧也可以促进和加速恶性进展和促进转移。因此，一旦可以鉴定出具有明显的肿瘤缺氧的癌症患者，则非常需要立即执行有效治疗以克服缺氧诱导的化学治疗和辐射电阻。在最近发展治疗缺氧性肿瘤的基础上，研究者将通过利用功能性纳米材料及其结构设计来评价两种治疗策略。首先，设计了具有强大治疗效果的各种纳米剂，以克服肿瘤缺氧。例如，一种强大的纳米吸收剂可以提供或产生敏化剂，使缺氧性肿瘤对治疗敏感。另一种强大的纳米药物对肿瘤缺氧表现出协同的治疗作用。更有趣的是，实验中设计了几个强大的纳米器件，以使PDT工艺对环境的O₂浓度依赖小。第二，一些特殊的纳米器件甚至可以利用缺氧作为缺氧性肿瘤反应性治疗的有利因素。极具吸引力的是，一些最近设计的探针可以巧妙地应对缺氧微环境，以引发有效的治疗。这些策略可以消除研究人员在治疗缺氧性肿瘤方面面临的障碍，这表明了癌症治疗的重大进展。

图17 通过MnO₂和过氧化物之间的反应生成O₂

7 总结与展望

在本文中，对于敏感检测和有效治疗癌症缺氧的功能探针的设计和构建的最新进展进行了总结和讨论。在检测缺氧的成果中，已经使用诸如荧光成像、PET、MRI和PAT之类的各种技术进行了对缺氧微环境的无创成像。显然，这些模式中的每一种都有自己的具体优点和缺点。相信上述问题如果得到解决，一定会在临床上得到良好的应用。

文献链接：Chemical Design and Synthesis of Functionalized Probes for Imaging and Treating Tumor Hypoxia（Chem.Rev.,2017,DOI: 10.1021/acs.chemrev.6b00525）

本文由材料人生物材料组李伦供稿，材料牛编辑整理。

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