南京大学蒋锡群Nature Biomedical Engineering：肿瘤成像光学探针领域新进展！
【引言】
肿瘤的早期诊断是一个重要的挑战，肿瘤组织具有不同于正常组织的特异性微环境，对肿瘤特异性微环境的成像对于研究肿瘤发生与发展的机理以及肿瘤的诊断有着极其重要的意义。对肿瘤标志物特异性响应的光学探针可以将肿瘤标志性特征的表达水平转换为光学信号的形式表现出来，从而直观地实现了对肿瘤微环境的定性或定量化研究。然而，由于许多肿瘤标志物的表达水平在肿瘤组织和正常组织中差异并不大，且相应光学探针的灵敏度有限，因而往往难以实现对肿瘤微环境的高特异性和信噪比的光学成像。
【成果简介】
南京大学蒋锡群（通讯作者）团队在解决肿瘤高特异性光学成像这一难题方面取得重要进展，并于北京时间2017年4月10日在Nature Biomedical Engineering上发表——题为“Successively activatable ultrasensitive probe for imaging tumour acidity and hypoxia”，论文第一作者是郑先创博士。该成果的亮点在于提出了一种连续放大肿瘤微环境信号的策略，创制了一种对酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针。和传统的开关（turn on/off）探针设计原则不同，该工作以病灶生物环境变化引起的探针信号波长的移动来实现探针信号的放大。同时，探针信号波长的移动又被进一步利用来反映病灶的生物学事件和参数。例如，这种探针在正常组织中发射出较弱的红色荧光，而在进入实体肿瘤之后，探针会首先对肿瘤的微酸性微环境进行响应，并转换成一种具有近红外荧光发射的报告分子，接着，该报告分子还能进一步对肿瘤的低氧微环境进行响应，伴随着其近红外荧光发射强度的增强（图1）。通过上述波长移动/荧光强度增强的连续响应，可以有效地实现对肿瘤微环境信号的两步放大。小鼠肿瘤模型的测试结果显示，这种两步连续响应的大分子光学探针在肿瘤成像中表现出了高于常规一步响应的光学探针一个数量级以上的信噪比。在小鼠肿瘤肝脏转移模型中，该探针能够高灵敏地检测到1毫米大小的微小肿瘤转移灶。这一研究工作为新型肿瘤微环境的光学成像，成像引导的肿瘤手术以及肿瘤治疗效果的评估等提供了新的工具。该探针同时也为疾病机理，细胞生物学和系统生物学的基础研究提供了一个功能成像的靶向探针。
【图文导读】
图1.探针的双刺激信号放大过程的原理及其光物理性质
a.探针进入肿瘤后的响应行为。当血管从血管渗出，进入肿瘤酸性的细胞外环境后，探针分子将被转换成报告分子，并伴随着荧光发射峰红移到近红外区域。随后，当报告分子暴露于乏氧微环境下时，报告分子的近红外发射又被进一步增强，从而形成对肿瘤微环境两步响应和放大。b、c.探针报告分子（b）和（c）两种状态的三维荧光光谱图。d.探针分子的血清稳定性测试表明：在610nm和705nm处24h以后还有强烈的发射演变。e.pH=5.5-7.4范围内探针的发射光谱，激发:450nm。f.探针报告分子在不同氧浓度下的发射光谱，激发：580nm。g. 报告分子位于705 nm 发射峰强度随氧分压降低而升高的曲线，激发：580 nm。
图2.探针对于细胞内酸性和氧浓度的响应以及肿瘤切片的免疫染色
a.细胞与探针分子(0.01 mM) 在不同pH 值 (6.0, 6.8, 7.4) 下共培养 2 h 后的激光共聚焦图片。图中所示的610 nm 信号对应于458 nm 激光器激发并在580-630 nm 区间检测，而705 nm 信号对应于543 nm 激光器激发并在680-730 nm 区间检测。pH 响应测试在同一氧分压（0%）下测试。b.pH 7.4 条件下，报告分子信号 (680-730 nm 通道) 与溶酶体染色剂 LysoTracker 信号在HeLa 细胞内的共定位情况。c.在pH=7.4和6.8时，探针分子和探针报告分子转换的机理。d. 在pH 6.0 条件下，HeLa 细胞与探针分子 (0.01 mM) 在不同氧分压下 (21, 10 , 5, 2.5 and 0%)共培养后的激光共聚焦图片。使用543 nm 激光器激发，信号在 680-730 nm 区间收集。e. 说明癌细胞两种代谢途径以及其之间相互联系的示意图。f. H22 肿瘤冰冻切片免疫荧光染色图片，HIF-1α 与LDH-A 共染。g. H22 肿瘤冰冻切片免疫荧光染色图片，哌莫硝唑 (PIMO) 与 MCT-4 共染。
图3.小鼠移植瘤模型的光学成像
a.右侧大腿负荷H22 肿瘤的ICR 小鼠通过尾静脉注射探针分子 (40 mg kg-1)后不同时间点的活体成像图。成像信号采集波长范围为670-800 nm，激发：595 nm。b.探针注射96 h 后的肿瘤和主要器官成像图片。c. 静脉注射探针后不同时间点，探针在肿瘤，血液或主要器官中的分布情况(n = 5)。d. 肿瘤和主要器官中归一化信号强度比较。归一化强度由不同器官上单位面积的信号强度除以该器官中Ir 配合物的体内分布浓度得到(n=5)。**P<0.01,使用ANOVA 方法比较。e. 探针报告分子注射48h 后的肿瘤和主要器官成像图片。f.肿瘤和主要器官中归一化信号强度比较,注射探针报告分子48h后。**P<0.01,使用ANOVA 方法比较。g.探针在活体中对于不同pH和氧浓度的响应,通过两个通道对小鼠进行成像，610nm检测探针分子以及705nm检测探针报告分子。
图4.转移性肝损伤以及原位肝癌肿瘤的检测
a．荷有MDA-MB-231乳腺癌肿瘤的小鼠注射探针分子后的全身成像，剂量：48mg/kg。b. 探针前体注射48 h 后的肿瘤和主要器官成像图片。c.放大之后的强反差的黑白图像凸显出转移瘤结节，基准尺1cm。d.解剖后肝脏的照片，肉眼可见转移瘤结节。e-g.ROI 1(e),ROI 2(f)和ROI 3(g)区域放大的强光和近红外图像,g图中箭头所指两个瘤块无法肉眼可见。h.三个ROI区域以及周围正常肝脏组织的信号强度，误差平均值± s.d. (n = 12). **P < 0.01, 使用 Student’s t-test比较方法。i，j：组织切片的免疫染色，左：H&E染色，右：抗体染色针对哌莫硝唑 (i) 与 MCT-4（j），红线表示肿瘤和正常组织的边界，基准尺：100um。k.注射探针24h后，荷有HCCLMS-Luc肿瘤裸鼠的全身生物发光成像以及近红外成像，注射剂量：40mg/kg。l. 注射探针24h后，解剖出的肝脏的生物发光成像以及近红外成像图，基准尺：5mm
图5.探针对于药物引起的胞内酸化率和耗氧率改变的响应
a．Oxamate, c. 2-DG 对细胞内探针信号的影响，药物处理过的4T1 细胞 (106) 和未经药物处理的 4T1 细胞 (106) 加入相同数量的探针分子后，分别被注射到小鼠的右侧和左侧大腿处，成像后，比较两边细胞产生的信号强度差异 (n=5)。**P<0.01，*P<0.05，使用Student’s t-test 方法。b,d. 测量4T1 细胞的氧消耗速率(OCR) 和细胞外酸化速率 (ECAR)。在20 min 测试时间点加入药物，来考察它们对氧消耗和细胞外酸化速率的影响 (n=8)。所用药物为：b. Oxamate, d .2-DG。e-l.同上方法，所用药物换成 FCCP, ryanodine，Oligomycin, rotenone，测试药物对细胞内探针信号以及细胞的ECAR 和OCR 的影响。
【小结】
该团队设计了一种对于肿瘤微环境酸化和乏氧连续响应的大分子光学探针，具有高信噪比，能检测到小于1mm的微小肿瘤病灶，这一研究工作为新型肿瘤微环境的光学成像，成像引导的肿瘤手术以及肿瘤治疗效果的评估等提供了新的工具。
文献链接：Successively activatable ultrasensitive probe for imaging tumour acidity and hypoxia（Nature Biomedical Engineering , 2017，doi:10.1038/s41551-017-0057）
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