王忠良Chem.Soc.Rev.最新综述：高性能荧光和生物发光RNA成像探针的最新进展

【引言】

RNA在生物的生命活动中起着重要作用。信使RNA（mRNA）和微型核醣核酸（miRNA）的成像不仅能够学习mRNA的形成和转录以及参与各种生命过程的miRNA的生物合成，而且有助于检测癌症。高性能RNA成像探针大大扩展了人们对生命过程的看法，增强了癌症检测的准确性。

近日，来自西安电子科技大学的王忠良教授、中国科学院田捷研究员、美国国立卫生研究院的陈小元研究员（共同通讯）等人总结了最先进的高性能RNA成像探针，包括可以对具有特殊修饰的RNA序列成像的外源探针和可直接成像而无需特殊处理的内源性探针，并对每个探针都详细地论述了其结构和成像原理。此外，还总结了mRNA和miRNA成像探针在研究生命过程以及检测癌症中的应用。上述内容以“Recent advances in high-performance fluorescent and bioluminescent RNA imaging probes”为题发表在了2017年3月27号的Chemical Society Reviews上。

综述总览图

1 简介

RNA在基因表达和调控中起重要作用。对于基因表达，mRNA是模板，而tRNA和rRNA分别是氨基酸和催化剂的转运蛋白。 对于基因调控，siRNA（小干扰RNA），miRNA和shRNA（短发夹RNA）可以以不同的方式调节基因表达。学习基因表达和调控不仅增加了对各种生命过程的了解，而且有助于疾病诊断和治疗。

基因表达和调控的可视化可以通过各种成像RNA（主要是mRNAs4和miRNAs）来实现。mRNA在基因表达和调控中起着核心作用，因此学习转录、定位、转运、翻译可以获得大量关于基因表达的信息。miRNA是控制mRNA基因表达的内源性调控RNA，因此miRNA的成像可以获得相应mRNA的基因调控信息。

RNA成像探针可以分为两种类型：探针成像外源RNA和成像内源RNA的探针。它们在结构和原理上有很大的不同，在前一种类型的RNA成像探针中，靶向RNA不是天然的内源性RNA，而是外部插入某些蛋白质结合序列的RNA。成像探针与插入的RNA序列（除了染色表达序列）特异性相互作用使得靶向RNA发光。目前，成像外源RNA的探针包括RBP-FP（RNA结合蛋白 - 荧光蛋白）系统，双分子荧光互补（BiFC），RNA适配体/荧光团系统和报告基因系统。在后一类型的RNA成像探针中，内源性RNA是天然内源性RNA，并且在成像之前不需要额外的预处理。

图1 各种外源和内源RNA成像探针结合靶向RNA的图解说明

2 探针成像外源RNA

外源RNA是外部插入某种蛋白质结合序列，染料结合序列或染料表达序列的RNA。目前，成像外源RNA的探针可分为RBP-FP系统，双分子荧光互补（BiFC）系统，RNA适配体/荧光团系统和报告基因系统四种。对于RBP-FP系统，成像探针与插入的蛋白质结合序列特异性相互作用，然后照射靶向RNA。对于BiFC，成像探针被分为两个非荧光部分，并且与相同靶向RNA中的两个不同的插入的蛋白质结合序列相互作用。只有当成像探头的两部分准确重合时，BiFC探针才会照亮靶向RNA，并且具有比RBP-FP系统低得多的背景信号。对于RNA适配体/荧光团系统，成像荧光团直接与插入的RNA适体（染料结合序列）相互作用并照射靶向RNA。该系统的成像速度比RBP-FP系统和BiFC系统快得多，因此可以用于实时成像。对于报告基因系统，插入的染料表达序列可以表达荧光团（如GFP）或荧光素酶。插入报告基因的3 UTR后，调节miRNA可以间接成像。由于所有这些探针必须与其相应的RNA合作进行适当的预处理，因此它们被分类为成像外源RNA的探针。

2.1 RNA结合蛋白 - 荧光蛋白系统（RBP-FP系统）

RBP是可以特异性结合MBS（MS2结合序列，RNA序列）的MS2外壳蛋白（MCP）。为了对目标mRNA进行成像，将mRNA在3'-UTR（非转译区）中进行预处理来包含 MBS 的6个单元，然后将MCP-GFP融合蛋白加入预处理的mRNA细胞中。MCP-GFP融合蛋白然后结合靶向mRNA并照射靶向mRNA。利用该系统，可以追踪活体酵母中ASH1 mRNA 的定位和转运。

图2 RBP-FP系统的结构

2.2 双分子荧光互补系统

为了减少来自RBP-FP系统的背景信号，将双分子荧光互补（BiFC）并入RNA成像中。在BiFC中，FP分为两个互补的非荧光部分：N端FP（N-FPs ）和C端FP（C-FP）。 由于N-FP和C-FP都不是带有荧光性的，所以游离蛋白质的背景信号变得可以忽略不计。

2.3 RNA适配体/荧光系统

将RNA适配体预插入目标RNA的3'-UTR中，与不存在靶向RNA时相比，荧光团的荧光在靶向RNA的存在下显着增加。RNA适配体/荧光团系统利用的是适配体 - 荧光团的相互作用，而不是RBP-FP系统或BiFC系统中RNA-RBP的相互作用。适配体和小分子荧光团之间的结合是快速的，因此该系统实现了实时成像。在该系统中，照射RNA适体可以大大增强荧光团的荧光。目前研究最多的荧光团是二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮（DFHBI），它是模仿eGFP结构的商业染料。

图3 RNA适配体/荧光团系统的不同结构

2.4 报告基因系统

报告基因系统专门用于miRNA成像。 通常21-25个单链RNA的miRNA是作为控制各种基因调节的序列调节器。 因此，报告基因系统主要应用于成熟miRNA功能的成像，虽然还研究了pri-miRNA（初级miRNA）转录，pri-miRNA切割，ds-miRNA和不稳定mRNA或抑制靶向基因的miRNA功能的成像，但是本文主要讨论了单一成像报告基因系统的miRNA功能。

图4 报告基因系统的结构

3 探针成像内源性RNA

与成像外源RNA的探针不同，成像内源RNA的探针不需要将某些RNA序列引入靶向RNA或转录报告基因。它们含有识别序列，并通过碱基配对互补形成内源RNA。在本文中，作者主要介绍了FISH探针，纳米MB和无猝灭探针。FISH探针通常是用荧光团标记的ssDNA或ssRNA，并且由于存在大量探针而能够以高分辨率成像的靶向RNA。MB是具有茎环结构（或β-发夹结构）的ssDNA或ssRNA，其中荧光团和猝灭剂位于茎部分，识别序列位于环区。 MB在茎环结构上不产生荧光，但在靶向RNA存在下会产生荧光，因此，MB探针也具有较低的背景信号。 MB不能自己进入细胞，因此对于活细胞成像，需要基因载体来递送探针。无猝灭探针是含有特殊荧光团的ssDNA或ssRNA，其在ssDNA或ssRNA结构中是非荧光性的，但在DNA / RNA双链体或dsRNA结构中具有荧光性。

3.1 FISH探针

FISH技术始于在20世纪80年代，最初是用于基因组成像。用于RNA成像的FISH探针是带有相同荧光团标记的ssDNA，ssRNA或混合ssRNA / DNA序列组，其序列与靶向RNA的不同部分互补。由于FISH探针是在不存在靶向RNA的情况下具有荧光性的，所以如果游离的FISH探针未被去除，背景信号将会很高。 因此，FISH探针只能在处于预处理的固定细胞中成像RNA，并且可以除去游离的FISH探针。

3.2 分子信标（MBs）

分子信标是用于RNA成像研究最多的探针。它们具有茎环DNA结构，识别序列位于环区。在茎区域，荧光团和猝灭剂处于非常接近的位置，首先导致MBs失去荧光性能。然而，一旦MBs暴露于靶向RNA，识别序列将与靶向RNA形成稳定的杂交双链体，并且茎-环结构将变成线性的，迫使猝灭剂远离荧光团，从而恢复荧光性。

图5 MBs的不同结构

3.3 纳米MBs

纳米MBs是指加载纳米颗粒的MBS，用其作为猝灭剂和载体，并且不需要额外的基因载体来递送探针。这里的纳米颗粒不仅仅是MBs的载体，而且还作为MBs上相邻荧光团的猝灭剂。

图6 不同纳米MBs的结构

3.4  无猝灭探针

与MBs和纳米MBs不同，无猝灭探针不需要猝灭剂来减少探针的初始背景荧光。 相反，这些无猝灭探针中的荧光团自身被淬灭。FIT探针和ECHO探针是典型的无猝灭探针。

4 RNA成像的应用

4.1 应用于追踪RNA过程

mRNA过程通常包括转录，定位，转运和翻译，通过跟踪新生RNA，显示强表达的持家基因在RBP-FP系统开发期间改变了转录脉冲的大小。通过用RBP-FP系统跟踪先前得mRNA，在活细胞中监测剪接体装配的动力学过程。通过用两组不同的FISH探针标记GFP前mRNA的外显子和内含子，将162个剪接过程用单分子灵敏度就达到可视化。

图7  成像应用于追踪RNA过程

4.2 癌症诊断中的应用

对于检测单个mRNA肿瘤标记物，MBs和纳米MBs已经成功应用于检测不同肿瘤细胞中的存活蛋白mRNA，MnSOD mRNA，c-raf-1 mRNA，TK1 mRNA，STAT5B mRNA126和K-ras mRNA170。多个mRNA肿瘤标记检测可以提高癌症检测的准确性，这可以很容易地被纳米MBs完成。

图8 在CLSM下的TK1 mRNA，存活蛋白mRNA，c-myc mRNA和GalNAc-T mRNA的细胞成像

【总结与展望】

RNA成像在以下两个方面非常重要。 首先，RNA成像可以跟踪RNA过程，如转录，定位，转运和翻译。其次，RNA成像可用于癌症诊断，因为某些mRNA或miRNA可以作为肿瘤标记物。 然而，RNA成像目前主要停留在细胞水平，体内成像非常罕见。本文总结了目前的高性能RNA成像探针，分析了其结构和成像原理，并将设计与其应用相关联，这可为将来优化电流探针提供指导。

文献链接：Recent advances in high-performance fluorescent and bioluminescent RNA imaging probes（Chem.Soc.Rev.,2017,DOI: 10.1039/C6CS00675B）

本文由材料人生物材料组李伦供稿，材料牛编辑整理。

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