Nature子刊综述：肿瘤纳米医疗：进展、挑战与机遇
【引言】
由于治疗肿瘤传统方法的固有缺陷，纳米技术被应用于治疗肿瘤以便提高效率和安全性（下文用肿瘤纳米医疗表示这种技术）。在这个领域中已经取得了很大的技术成就，但是肿瘤生物学的复杂性和异质性、对纳米-生物相互作用了解的不完全性、以及在临床转化和商业应用中对化学、制造和控制的苛刻要求成为纳米医疗的主要障碍。最近哈佛医学院的Omid C. Farokhzad（通讯作者）等人发表了一篇关于肿瘤纳米医疗的综述，这篇综述突出了肿瘤纳米医疗的进展、挑战和机遇，还讨论了几种提高肿瘤治疗效率的新颖的工程方法，这些方法是随着对肿瘤生物学、纳米-生物相互作用理解的加深而提出来的。
1、简介
将纳米技术应用于肿瘤治疗受到广泛关注（图1），这主要归功于其在药物输运、诊断、成像、发展合成疫苗和微型医疗装置中的独特作用，以及某些纳米材料本身具有的治疗效果（Box1）。具有某些特征（如促进的循环周期、降低的毒性）的纳米疗法已经实现了临床转化，其它的在临床转化中表现出很大的潜力，在不久的将来就会有结果。有几种治疗性的纳米平台已经被许可用于癌症治疗，如脂质体、白蛋白纳米颗粒和聚合物囊泡，更多的治疗模式正在进行临床试验，如化学疗法、高温疗法、辐射治疗、基因或者RNA干扰（RNAi）治疗以及免疫疗法（表1）。
Box 1 纳米技术在肿瘤应用中的独特特征
尽管肿瘤纳米医疗取得了很大的进步，我们逐渐意识到在前面存在的挑战与机遇。首先，肿瘤生物学的复杂性和异质性要求仔细选取病人以便确定哪些病人能够受益于给定的疗法，这类似于已经被许可或者正在发展的用于具有某种生物标记物的病人群体的靶向疗法。大多数治疗实体肿瘤的纳米颗粒都是全身给药的，它们通过高通透性和滞留效应（EPR）在肿瘤中富集，EPR被认为是肿瘤血管渗漏和淋巴引流差的结果 ，但是这种理解过于简单，因为在纳米颗粒的全身输运过程中很多的生物过程会影响EPR，如纳米颗粒-蛋白质相互作用、血液循环、纳米颗粒渗入并且与血管周围的肿瘤微环境（TME）作用、肿瘤穿透以及细胞内化。反过来，纳米颗粒的性质（如尺寸、性质、表面特征、孔隙率、成分和靶向配体）也会影响这些生物过程，从而影响EPR和治疗效果（图2）。然而应当指出，目前对纳米颗粒在活体内行为的理解大部分来源于动物实验数据，将这些行为移植到人体内的研究还非常少。虽然已经有几个实验研究了纳米颗粒在不同物种中的前临床和临床药物动力学表现，很少有相关的数据能够根据动物实验结果预测其在人类身上的安全性和效率。
这篇综述致力于探讨为什么癌症纳米医疗还不能发挥其延长病人寿命的潜力，以及对目前关于肿瘤生物学和纳米-生物相互作用的理解进行概括。由于EPR的重要作用，我们提供了在研究EPR和确定其生物标记物从而预测其对纳米颗粒的响应、以及发展新的策略来提高EPR和治疗效率方面的最新进展。我们还讨论了发展靶向TME纳米技术的基本原则，最后就肿瘤纳米医疗临床转化中存在的困难提出了我们的看法。
图1 肿瘤纳米医疗发展中的关键时间点
（注：EPR：高通透性和滞留效应； FDA：美国食品药品管理局；nab：白蛋白限制纳米颗粒；NP：纳米颗粒； PRINT：非润湿模板复形法）
2、纳米医疗平台的种类
纳米技术在过去的几十年间对肿瘤学的发展做出了重要贡献（图1，表1）。脂质体是第一种被许可用于临床中治疗肿瘤的纳米颗粒，与其它基于脂质体的纳米颗粒一起，在临床阶段的纳米疗法中占有很大的比例。虽然将药物包裹在脂质体中能够改善药物动力学和生物分布，但是与传统的药物相比，市场上的脂质体治疗药剂并不能提高总的存活率（OS）。最近在急性髓系白血病病人身上进行的第三阶段试验结果表明脂质体包裹阿糖胞苷（cytarabine）-道诺霉素（daunorubicin）（Vyxeos）能够提高OS（从5.95个月提升到9.56个月），Vyxeos的许可申请在2016年底已经提出。纳米白蛋白包裹的紫杉醇（paclitaxel，Abraxane）是第二种商业化的纳米医疗，纳米白蛋白能够加载疏水性药物而且大大减少了有毒物质的使用，使其能够被注射更大的剂量和具有更快的给药速率，从而提高Cmax（注射后药物或者纳米颗粒在血浆中所能达到的最大浓度）和血浆AUC（血浆中药物浓度-时间关系曲线下的面积）。静脉注射后Abraxane快速解离为白蛋白和紫杉醇，并且对紫杉醇的药物动力学和生物分布没有潜在的影响。虽然在3周一次的用法中Abraxane比紫杉醇性能更优（就它们对乳癌病人的肿瘤扩散的响应速率和响应时间来说），一周一次的用法对非扩散肿瘤和OS并没有表现出相同的趋势，并且还增加了毒性。聚合物囊泡（如GenexolPM和 NK105）和聚合物纳米颗粒（如CRLX101 、BIND014 和AZD2811）是两种更新型的纳米治疗药剂，最近BIND014、CRLX101和NK105的临床试验结果令人失望，突出了重新考虑发展策略，包括对病人的选取来确定那些最有可能对纳米医疗响应的病人的重要性。无机纳米颗粒（如金纳米壳、四氧化三铁纳米颗粒、氧化铪纳米颗粒）也被用于纳米治疗，基于四氧化三铁的NanoTherm已经在欧洲商业化用于治疗恶性胶质瘤。
更引人注目的是，我们对纳米-生物相互作用的理解和纳米医疗平台的种类都在急速增加。PubMed上关于“nanoparticle”的文章总数在2000到2014年间差不多每两年都会翻一番，超过了1980年代关于单克隆抗体（mAb）文章的增长速度。mAb的文章转化成了重要疗法的发展，我们相信这在纳米医疗也会同样发生。
除了作为化学疗法的载体外，纳米颗粒输运其它的抗癌物质也很有潜力（如分子靶向剂、反义寡核苷酸、siRNA、mRNA）。进一步，基因和化学工程技术还促进了病毒纳米载体的发展，例子包括用欧洲委员会许可的肌注腺伴随病毒治疗脂蛋白脂酶缺乏、目前处于各种临床阶段的用于基因治疗和和免疫疗法的慢病毒、用在动物身上进行肿瘤治疗的工程植物病毒（如烟草花叶病毒、马铃薯X病毒）。用外来体和新型的无机纳米颗粒（如纳米金刚石和石墨烯）作为载体也引起了人们的兴趣。
将诊断和治疗功能集成在一种纳米颗粒中可以获得治疗诊断纳米医疗平台，这种平台可以监控药物动力学、治疗药物的积累以及疾病的发展，进一步研究肿瘤内和病人间的异质性，从而发展个性化医疗。通过同时输运几种活性药剂，纳米颗粒能够促进协同治疗以及避免某些抗药机制，如表2中的样品所示。除了输运药物外，纳米技术也在免疫疗法治疗癌症领域发力，纳米颗粒作为抗原或者佐剂的载体用于发展合成疫苗受到越来越多关注，因其具有更好的组织穿透力、被淋巴系统获取能力、更容易被表达抗体的细胞摄取、能持续释放抗原或者佐剂以及更强的吞噬体逃逸能力。
纳米技术有很大的潜力能够克服生物制剂的缺点，包括用于免疫疗法治疗癌症的mAbs。比如直接注射生物制剂会诱导抗药抗体（ADAs）的生成，从而严重影响他们的安全性和效率。最近用致耐受性的纳米颗粒加载纳巴霉素可以防止生物制剂在小鼠和非人类灵长类动物中诱导ADAs的形成，目前这方面的人类临床试验正在进行。我们预计随着对纳米-生物相互作用理解的加深、纳米医疗的私人化、以及将纳米技术应用到现存的或者即将出现的治疗模式中，我们会充分发挥纳米医疗在治疗肿瘤和其它疾病中的潜力。
表1 处于临床阶段的治疗肿瘤的纳米颗粒的例子
表2 老鼠肿瘤模型中纳米颗粒辅助结合治疗的例子
3、可预测医疗中的EPR
尽管在发展非侵入式纳米颗粒给药（如口服、肺、鼻、或经皮给药）方面做了很多努力，目前大部分的纳米治疗药剂是通过静脉注射再经全身递送到达肿瘤的。纳米颗粒在肿瘤的优先富集经常被归功于肿瘤中有缺陷的血管和受损的淋巴：畸形的肿瘤微血管增强了可渗透性从而使纳米颗粒能够进入肿瘤的间隙，而受到抑制的淋巴引流则使纳米颗粒能够滞留在组织中。EPR是纳米颗粒运输到实体肿瘤的基础，然而越来越多的证据表明EPR不仅在不同病人和不同肿瘤中表现不一样，同一病人或肿瘤中的EPR也会随时间变化。但是探讨EPR对纳米治疗效率影响的研究还很少，几个前临床研究表明有必要按照纳米颗粒通过EPR富集的难易程度将病人分类，预示着EPR中可预测的生物标记物可能对纳米医疗的临床成功起到重要作用。
在我们前面关于EPR的综述中，我们讨论了TME的参数，其中某些参数与纳米颗粒的作用已经被很好表征，而其它的则仍然是有待研究的“黑匣子”。最近肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在纳米颗粒-TME作用中起到的作用受到重视，TAMs也被认为是纳米治疗药剂的仓库，有效的治疗药物从中逐渐释放到附近的肿瘤细胞中。最近有研究者用高分辨活体成像光谱技术系统地研究了两种不同纳米颗粒的渗透和其在肿瘤内的分布：临床许可的30nm磁性纳米颗粒ferumoxytol（MNP）和90nm的PLGA-PEG聚合物纳米颗粒。尽管尺寸和成分不同，同时进行静脉注射后它们表现出相似的药物动力学，以及在肿瘤细胞和TAMs中有不同程度的共同富集。进一步将MNP和加载紫杉萜的PLGA-PEG共同注射后，肿瘤间的MNP水平受到纳米颗粒载药水平的显著影响，所以MNP的富集水平成功预测了治疗性聚合物纳米颗粒的治疗效率。最近的一项研究评估了将ferumoxytol作为预测纳米脂质体-依立替康MM398治疗效果标记物的可能性。对6个癌症患者病变尺寸减少的分析表明它们（减少的尺寸）与24小时后病变区域中的ferumoxytol水平呈现正相关（图3a）。
用放射性同位素（如111In、99mTc、123I 和64Cu）标记的治疗纳米颗粒也被用来监控纳米颗粒的生物分布和肿瘤富集，使用的成像方法包括单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、计算机断层扫描（CT）、正电子成像技术（PET）。最近的临床研究表明肿瘤中脂质体-阿霉素（LD）的富集水平与与病人的响应和存活率正相关（病人患有不可切除的胸膜间皮瘤并且用LD和顺铂共同治疗）。用64Cu标记的脂质体对犬类肿瘤进行PET-CT成像同样显示出了肿瘤富集的异质性，7个肿瘤患者的中的6个表现出了高的脂质体吸收效率，而4个肉瘤患者只有一个表现出高吸收。这些结果突出了放射性同位素标记的治疗纳米颗粒在评估病人对纳米疗法适应性中的作用（图3b）。尽管在治疗纳米颗粒中加入造影剂也能够用来研究肿瘤异质性和EPR，这些纳米颗粒在设计、合成、规模化、监管方面的复杂性会增加。
除了发展成像纳米颗粒作为治疗效率的标记物以外，有些研究已经致力于确定可以预测EPR的基因、蛋白或者细胞生物标记物（图3c）。循环中基质金属蛋白酶9（MMP9）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）的比率、血管中的胶原蛋白含量被证明可以预测脂质体的EPR。与血管再生相关的循环生物标记物已经被介绍，如血管生成因子（血管内皮生长因子A、成纤维细胞生长因2、MMP9、白细胞介素-8、白细胞介素-6和肝细胞生长因子）、蛋白质和肽（如内皮抑素和肿瘤抑素）、内皮细胞和内皮祖细胞。然而它们与其它潜在生物标记物在预测EPR中的作用还有待在临床研究中验证。
图2 纳米颗粒性质对系统运输的影响
（a）纳米颗粒可以用不同材料制备，拥有不同的物理化学性质（如尺寸、几何形状、表面性质、弹性和硬度），以及能修饰不同密度的不同种靶向配体；
纳米颗粒的性质会影响输运时的生物过程，包括（b）与血清蛋白的相互作用，（c）血液循环，（d）生物分布，（e）渗透入血管周围肿瘤微环境和穿透肿瘤，（f）肿瘤细胞靶向和胞内运输；
（g）纳米颗粒可以具有控制释放行为。（注：ID代表注射剂量）
4、增强药物输送到肿瘤
4.1 纳米颗粒-蛋白质相互作用
当纳米颗粒进入到生物环境中（如血液、细胞间体液和细胞外基质），它们的表面会迅速被生物分子覆盖（主要是蛋白质），形成“冠冕”（图2b）。吸附的蛋白质改变了颗粒的尺寸、稳定性和表面性质，更重要的是为纳米颗粒提供了一个决定其所能引起的生物响应的生物身份（这种响应包括细胞摄取、胞内输运、药物动力学、生物分布和毒性）。如调理素的吸附使得纳米颗粒被单核吞噬细胞系统识别和清除，相反富含不良调理素（dysopsonin）蛋白（如阿朴脂蛋白和白蛋白）的冠冕，由于这些蛋白可以抑制吞噬细胞的摄取，从而增强了纳米颗粒的隐蔽效应。尽管配体修饰的纳米颗粒形成蛋白质冠冕后可能会失去靶向性，用某些特定的血浆蛋白修饰纳米颗粒能提高其对某些器官的靶向性。最近的一个例子表明阿朴脂蛋白E对siRNA脂质体在体内靶向肝细胞至关重要。相反纳米颗粒-蛋白质相互作用在临床中也可能通过激活补体系统引起过敏反应。
应用多种分析技术，几个实验已经广泛表征了某种纳米颗粒（如金、二氧化硅、聚苯乙烯纳米颗粒和脂质体）上的蛋白质冠冕（如其成分、密度、构型、厚度、亲和性和动力学）。现在已经清楚纳米颗粒-蛋白质相互作用高度依赖于纳米颗粒的物理化学性质、暴露时间、蛋白质来源和浓度。然而我们还是不怎么了解纳米颗粒性质（图2a）和吸附的蛋白质类型（图2b）跟特定的生理反应之间的关系（图2c-f）。通过对105种不同金纳米颗粒表面吸附的白蛋白进行表征，建立了一个定量的多变量模型来预测纳米颗粒与细胞的相互作用。17种脂质体的蛋白质冠冕和物理化学性质最近被用来预测纳米颗粒与不同癌细胞的生物作用（包括细胞摄取和存活率）。不同人类疾病对蛋白质冠冕成分的影响，以及其对纳米颗粒细胞摄取和毒性的影响也引起了人们的关注。然而大部分的研究关注体外的纳米颗粒-蛋白质相互作用，在体内以及其对药物动力学、生物分布和治疗效率的影响的研究则很少。值得注意的是，仅有的体内评估蛋白质冠冕的试验表明体内和体外试验结果有明显的差别。
我们相信解决下面的问题会促进这个领域的发展：我们是否需要使用特定的蛋白质基因敲除小鼠来验证和解释体外试验和正常老鼠身上的试验结果？除了广泛研究的血清中的蛋白，其它生理环境中的蛋白（如TME）会对冠冕、纳米颗粒-肿瘤细胞相互作用以及纳米颗粒穿透肿瘤细胞外基质有什么样的影响？我们需要怎样的新技术来更精确的表征和定量蛋白质冠冕？我们期望通过将定量的结构-反应性关系的方法论拓展到其它纳米平台和生物响应中，这种方法会加深我们对纳米-生物界面的理解和控制，帮助设计出安全、高效甚至病人特异的纳米医疗。
图3 预测EPR和治疗效率的潜在标记物
（a）显像剂被用来预测纳米颗粒的富集和抗癌活性；
（b）在前临床和临床中使用显像剂标记的治疗性纳米颗粒（称为治疗诊断纳米颗粒）来监控生物分布和肿瘤富集；
（c）血清和组织生物标记物也能作为EPR的标记物，正如肿瘤中的脂质体富集与基质金属蛋白酶9和金属蛋白酶抑制剂1比率的关系所展示的那样。
4.2 血液循环
纳米颗粒从微血管渗透入TME的效率与其在血液中循环的半衰期有关（图2c）。对于血流量大并且纳米颗粒容易渗透微血管的组织来说，只需相对短的循环半衰期就能使纳米颗粒达到所需的富集；相反，对于低灌注或者纳米颗粒不易渗透微血管的组织，就需要长的循环半衰期来确保有效的渗透。
纳米颗粒与血清蛋白的非特异相互作用是限制循环时间的一个主要因素，它能增强调理素作用和被单核细胞吞噬系统识别。在纳米颗粒表面嫁接PEG是应用最广泛的增强循环周期的方法，比如Doxil，它的循环半衰期接近两天。虽然PEG化纳米颗粒能够通过其亲水性和空间排斥效应减少蛋白质的吸附从而避免被单核细胞吞噬系统清除，这个用于隐蔽长循环周期颗粒的过于简单的方法正在变得过时（这个概念在25年前提出，“Stealth”现在是Liposome Technology, Inc.的一个商标）。例如，增加金纳米颗粒表面的PEG密度能降低吸附量以及改变吸附蛋白质的种类，从而减少被吞噬细胞摄取；聚苯乙烯的PEG化被证明能够选择性增强丛生蛋白的吸附，有助于减少吞噬细胞的非特异吸收。纳米颗粒的机械强度和弹性对单核细胞吞噬系统清除也有影响。
另一种增强纳米颗粒的血液循环周期的策略是用本征标记物（self marker）来修饰纳米颗粒，本征标记物能够防止单核细胞吞噬系统的激活从而保护正常细胞。自下而上的方法是将本征标记物（如CD47肽）化学地共轭到纳米颗粒的表面，从而抑制吞噬作用；自上而下的方法是用红细胞、白细胞、血小板等薄膜包裹纳米颗粒，从而“隐蔽”纳米颗粒不被单核细胞吞噬系统清除。虽然包裹细胞薄膜的纳米颗粒的循环周期比“裸”颗粒强，但还是比细胞本身短得多，因此还需要研究细胞包裹纳米颗粒后其自身细胞膜的改变，包括成分和弹性。
4.3 渗透入TME
纳米颗粒从血液循环中渗透入肿瘤的过程受到肿瘤血管畸变、血管周围TME和纳米颗粒本身的影响。肿瘤细胞的快速分裂所需的新陈代谢导致结构上畸变的新血管的生成。不像正常血管中的内皮细胞用1000天来更新自己，肿瘤中的内皮每隔10天就翻一番，因此形成的微血管没有确定的形貌，包括特殊的小静脉、小动脉和毛细血管等。对于发炎来说，免疫细胞的渗透主要发生在小静脉层次，而对肿瘤新生血管中的每一部分对渗透性的贡献还所知甚少。除了炎症调节因子（如组氨酸）外，紧密连接调制子（如阳离子聚合物）与内皮细胞的相互作用也会导致内皮细胞收缩和紧密连接解体，从而导致血管渗漏。对于肿瘤来说，血管通透性和血液流速很复杂，并且不同部分在动力学上也不同。血管通透性随时空的变化能部分的用肿瘤血管壁上瞬时打开和关闭的孔来解释（称为动态孔），对于循环周期足够长的纳米颗粒来说，动态孔能够促进纳米颗粒运输到肿瘤（尤其大颗粒），另外血管调节因子（如一氧化氮、血管紧缩素Ⅱ）也能增强血管的通透性。血管和TME的不同部分的血液流速和膨胀压也有差别，影响了纳米颗粒进出肿瘤间质组织的运动。更深入的研究会帮助我们理解纳米颗粒渗透入肿瘤的机制，改善制备和设计策略从而使纳米颗粒更好地富集。
纳米颗粒的物理化学性质对其渗透性和富集也有影响，比如在鼠科结肠腺癌中，30、50、70、100 nm的聚合物囊泡具有相似的渗透性和抗癌活性，而在胰腺癌中，只有30nm的颗粒能被有效富集。这项研究进一步说明肿瘤异质性对治疗效率的影响，突出了个性化医疗的重要性。与球形纳米颗粒相比，一些长的纳米结构（如纳米虫、纳米棒）能提高肿瘤富集效率。非球形纳米颗粒与球形或半球形纳米颗粒相比更倾向于富集和粘附在血管壁的内皮细胞上，增强位点特异的输运。
另外一些独特的策略也被提出用来增强纳米颗粒的渗透性，利用某些细胞（如间充质干细胞、吞噬细胞、单核细胞）的肿瘤靶向性，将纳米颗粒吸附到这些细胞的表面或者加载到细胞中就能靶向癌细胞。最近一种新的方法用两种“通讯（ communicating）”的纳米颗粒来增强肿瘤靶向性和富集：“信号发射”的金纳米颗粒通过光热效应破坏肿瘤血管壁引发血管外凝血，循环中的“信号接收”纳米颗粒识别这个信号而粘附到血块中。
4.4 肿瘤穿透
尽管强调渗透和富集在纳米颗粒输运中的重要性，深度并且均匀的肿瘤穿透对治疗效率也有影响。对大分子（如右旋糖苷、抗体）的研究表明尺寸和结合亲和性对扩散动力学和组织穿透深度有影响。比如对癌细胞表面抗原具有更高亲和力的抗体的穿透能力更低，因为结合力强的抗体会跟目标紧紧结合从而被内化，而结合力弱的抗体则能摆脱目标而穿透得更深。从关于抗体的研究中我们能学习如何设计肿瘤靶向的纳米颗粒，比如说在表面修饰靶向配体能增强细胞吸收和纳米颗粒在组织的停留时间，但是它也会降低肿瘤的穿透深度。
治疗纳米颗粒通常会比抗体大，倾向于被微血管附近的细胞外基质捕获（图2e）。遇到的困难包括TME的内在障碍（如由胶原蛋白和其它蛋白组成的稠密的间质基质）、增强的组织间隙液压（由畸形血管的高渗透性和缺失淋巴组织导致）。血管周围的基质细胞（如TAMs）的非特异性吸收也会阻碍纳米颗粒的扩散。值得注意的是肿瘤中毛细血管的平均间隔为80到几百微米，是纳米颗粒到达肿瘤的又一个障碍。
为了增强肿瘤穿透能力，一种可行的方法是调节纳米颗粒表面的物理化学性质使其能穿透间质基质的扩散障碍。小颗粒能更好的在肿瘤中扩散，但太小的颗粒（如小于5nm）会被肾过滤快速清除。并且小颗粒有很大的比表面积、药物在其中的扩散也很短，因而限制了它们的载药量和控制药物释放的能力。纳米棒（15nm×54nm）比直径35nm的球形纳米颗粒能更快穿透肿瘤，这可能与它们具有更小的维度有关，尽管它们的流体动力学直径接近并且在水中的扩散速率几乎相等。另外，用肿瘤特异的穿透性蛋白（如环肽CRGDK/RGPD/EC）修饰也可以增强纳米颗粒的肿瘤穿透力。用实时活体成像技术系统的研究纳米颗粒-TME相互作用能够确定拥有最优渗透性的纳米颗粒所需的性质。TME改性的方法，如降解肿瘤的细胞外基质、抑制肿瘤相关成纤维细胞的活性从而减少基质组分的合成，也有助于纳米颗粒穿透肿瘤组织。
最近提出了一种新的多步输运策略来克服穿透问题，小分子药物共轭体（SMDCs）、微型生物药物共轭体（mBDCs），其中包括肽-药物共轭体，被用来解决抗体-药物共轭体尺寸大的缺点，正是大尺寸限制了它们的穿透性。 SMDCs 和mBDCs与自由药物相比能够增强肿瘤的停留和细胞吸收。但是它们的缺点（如药物动力学差）可能会影响它们的治疗效果。通过将 SMDCs和mBDCs引入到聚合物纳米颗粒中组成多步输运系统，能够结合纳米颗粒（药物动力学好、肿瘤富集能力强）和 SMDCs 与mBDCs（穿透能力强、肿瘤细胞特异靶向）的优点从而获得最好的治疗效果。
也有报道提到了相似的多步输运系统，他们首先将非常小的纳米颗粒（如10nm的量子点）加载到大颗粒中（如3.5μm的半球形介孔硅、100nm的白明胶纳米颗粒），当大颗粒到达肿瘤血管或者暴露在TME中，小颗粒被释放出来，接着扩散到肿瘤中。
4.5 细胞吸收和胞内运输
有效的细胞内化对增强纳米颗粒的滞留、EPR和治疗效率（由于很多纳米医疗作用于细胞内的目标）也很重要，特别是对运输生物大分子（如siRNA、miRNA）来说。增强细胞吸收的方法之一是用能识别癌细胞表面特定受体的靶向配体修饰纳米颗粒（图2f），当EPR失效（如血管靶向）或者治疗药剂的运输需要激活生理障碍的转胞吞作用（如肠粘膜、血-脑屏障）时主动靶向就很重要了。由于纳米颗粒主动靶向在30多年前就被提出来了，现在一些样品已经进入了临床试验阶段，包括靶向脂质体（如HER2）、第一个靶向并且可控释放的聚合物纳米颗粒（BIND014）、第一个靶向siRNA纳米颗粒（CALAA01）。甚至在没有靶向配体的情况下，也可以通过调节纳米颗粒的尺寸和形状来增强肿瘤细胞的吸收。
另外，研究癌细胞变异对纳米颗粒内化的影响也很重要。KRAS 变异的胰腺癌细胞对蛋白质（如白蛋白）的巨胞饮能力增强，并且在谷氨酰胺饥饿后细胞外白蛋白增强癌细胞增殖的能力也取决于致癌基因KRAS的表达。这项成果表明聚胞饮能够增强药物的吸收（如将紫杉醇吸附在白蛋白中），也部分解释了为什么用这种颗粒（白蛋白-紫杉醇）治疗晚期胰腺癌能取得成功。这种基因突变是否对纳米颗粒的内吞作用有影响还不清楚。应该注意，我们现在对纳米颗粒-细胞相互作用的理解主要来源于体外实验，它是否反映体内癌细胞的异质性还不清楚。最近在高分辨活体细胞成像技术方面取得的进展使得我们能够仔细分析单细胞的药物动力学和细胞-细胞间的不同，并且有望应用于在活体内观察纳米颗粒与肿瘤细胞和TME的相互作用。
纳米颗粒内化后，必须释放治疗药物使他们扩散到达靶向目标或者通过胞内运输通道的引导到达适当的亚细胞区域再释放药物。对于生物大分子（如siRNA）的运输，纳米颗粒的内涵体逃逸至关重要，阳离子脂质和类脂质材料、聚合物基纳米颗粒运输siRNA有很大的潜力，临床试验中治疗癌症的RNAi纳米药剂主要由脂质体或脂质纳米颗粒组成（表1）。虽然目前这些基于脂质的纳米颗粒没有修饰配体用于主动靶向，能靶向的纳米颗粒会进一步增强肿瘤富集、滞留和siRNA的细胞吸收。尽管在临床试验上的成功，脂质纳米颗粒辅助siRNA从内涵体的释放效率还很低（1-2%），大约70%内化的siRNA会经历胞吐，因此需要发展一种能够高效逃离内涵体的纳米颗粒。除了细胞溶质运输外，有时也要靶向细胞器（如细胞核、内质网、核糖体、高尔基体），虽然能被细胞器特异吸收的纳米颗粒已经被开发出来，细胞器膜对纳米颗粒运输的阻碍作用还需进一步研究。
4.6 可控药物释放
一个同样重要但是经常被忽略的因素是：全身给药的纳米颗粒在循环过程中会逐渐释放其中的药物（图2g），经过长期循环到达TME后纳米颗粒的载药量会降低。因此实现最优的治疗效果需要同时考虑药物释放、纳米颗粒的药物动力学、纳米颗粒的渗透。
我们认为设计最优的纳米系统需要深入理解几个复杂的参数：纳米颗粒动力学和药物动力学相互影响、被包裹药物和已经被释放药物的相互影响、药物Cmax和纳米颗粒Cmax之间的相互影响、药物AUC和纳米颗粒AUC的相互影响；以及对血清和肿瘤药物动力学和AUC影响不同的因素。传统的小分子药物在血浆中的含量在静脉输注期就会达到最大值，随后逐渐降低，而在使用纳米颗粒包裹药物使其可控释放时，被释放的药物在血浆中的含量开始会非常低，随后慢慢增大，最后在循环时达到最大值，更重要的是后者的最大值不太可能达到前者的最大值，因此纳米颗粒会降低与最大药物浓度相关的毒性。另一方面，自由药物和纳米颗粒释放药物的AUC很相似，只有一个主要的不同点：它们的形状不同，纳米颗粒控制药物释放的图形（血浆中药物浓度与时间的关系曲线图）很宽很平缓，而自由药物的图形会出现一个陡峰和长的尾巴。因此它们与AUC相关的毒性相似，甚至纳米颗粒的会更难克服。用纳米颗粒运输药物时，肿瘤内的药物动力学和AUC会跟用传统方法给药的非常不同，部分是由于EPR导致纳米颗粒在肿瘤的富集比自由药物的大的多，并且由于局部的纳米颗粒将药物释放出来使肿瘤中的药物含量长期比自由药物的高。大部分的出版物都证明纳米颗粒增强了药物运输到肿瘤的效率，部分的研究表明随着时间的推移肿瘤内的药物最大含量、药物动力学和AUC会比自由药物有所改善。但是提高药物在肿瘤中的富集并不一定会改善病人的总存活数，这就产生了几个问题：这种富集是普适的还是只对某些人群适用？是否对全部药物来说提高其在肿瘤中的浓度都是有益的，还是对部分药物适用？
为了精确控制药物的释放，发展了一系列刺激响应的纳米颗粒，这些纳米颗粒通常会对与TME和肿瘤细胞相关的细微改变敏感（如pH、氧化还原状态、酶），或者能被外部刺激激活（如光、热、磁场、超声波）而释放药物（图2g）。在某种程度上，外部刺激能在时间和空间上控制药物的释放。热响应脂质体（如ThermoDox）控制药物释平台放是目前最先进的临床阶段平台。2013年，ThermoDox在肝细胞癌非扩散存活率的第三阶段试验中达不到主要终点的要求，而现在正在进行以总存活数为主要终点的第三阶段试验。更加新型的刺激响应纳米材料包括pH或氧化还原敏感的聚合物纳米颗粒、超声波响应的嫁接聚合物的二氧化硅纳米颗粒、近红外光响应的氧化石墨烯纳米片，这些系统的临床表现还有待研究。
5、靶向TME和肿瘤细胞转移前微环境
由于TME在肿瘤发展、扩散、转移、耐药性的出现中扮演重要角色，它也成为治疗肿瘤的靶向目标。如前所述，TME改性是增强纳米颗粒肿瘤富集和穿透性的可选方法之一。与靶向肿瘤细胞相比，靶向TME中的非肿瘤细胞的一个好处是它们基因上更稳定因此更不容易形成耐药性。然而靶向非肿瘤细胞的困难在于减少对正常细胞毒性的同时获得良好的治疗效果。TME改性如何影响肿瘤生长和转移还需进一步研究。除了原发性肿瘤的TME外，转移癌细胞存活和增殖所需的环境也成为新型治疗方法的目标，对早期形成的肿瘤细胞转移前微环境进行干扰可能对于治疗倾向于转移的恶性肿瘤特别有用。
5.1 肿瘤血管
很多研究致力于用纳米颗粒将药物运输到对肿瘤的生长和转移非常重要的血管中（图4a）。这经常通过配体修饰纳米颗粒实现，这些配体能与肿瘤内皮细胞表面过度表达的适体（如αvβ3 整合素）发生特异性结合。体内研究表明抑制血管再生能使现存肿瘤消退或者抑制其转移。除了靶向纳米颗粒，几种非靶向的阳离子脂质或者聚合物纳米颗粒也被设计用于将siRNA优先运输到血管内皮细胞。一种叫做7C1的新配方在使用低siRNA剂量时能有效降低目标内皮细胞的基因表达，而不会影响它们在肺免疫细胞、肝或腹腔免疫细胞中的表达，通过沉默参与血管再生的VEGE受体1和类三角洲蛋白4，7C1纳米颗粒降低了小鼠体内路易士肺癌的生长和转移，这个有趣的系统也能用于研究材料与血清蛋白的相互作用如何引导纳米材料到内皮细胞中。
图4 纳米颗粒靶向肿瘤微环境和转移前肿瘤微环境
（a）靶向肿瘤微环境中的血管或者基质细胞；
（b）靶向转移前肿瘤微环境，如骨髓；
（c）用配体修饰纳米颗粒能够使其进行细胞特异的靶向，这些配体能够与肿瘤内皮细胞、基质细胞或其它靶向细胞表面的受体结合。应该注意，即使没有配体，也能使纳米颗粒被某些细胞优先吸收。
5.2 基质细胞
靶向基质细胞（如肿瘤相关成纤维细胞、巨吞噬细胞）也被用来进行癌症治疗（图4a）。一种叫做Cellax的紫杉萜共轭纳米颗粒能有效耗尽表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的成纤维细胞，降低肿瘤中的ECM和IFP，增强血管通透性和抑制肿瘤转移。这个效应可能是通过在Cellax吸附血清白蛋白，随后与α-SMA+成纤维细胞（同样过度表达白蛋白结合蛋白质）发生特异作用，分泌酸性的富含半胱氨酸的糖蛋白。肿瘤相关巨吞噬细胞（TAMs）分化为致癌或抑制免疫反应（类M2）的显型经常被与肿瘤转移或者不好的结果相关联。通过抑制信号传导子及转录激活子的活性，加载肼基姜黄素的纳米颗粒能够“改造”TAMs，使其由类M2显型转化为抗肿瘤发生的M1显型从而抑制肿瘤的生长。用PEG隐蔽、甘露糖修饰的纳米颗粒能有效靶向过度表达甘露糖受体的TAMs，同时MPS中巨吞噬细胞的吸收量最低。基于纳米颗粒的同时运输多种组分的药剂能够同时靶向TME和肿瘤细胞从而实现协同的抗癌效果。
5.3转移肿瘤微环境
一种新发展的由聚合物-药物共轭体组成的聚合物囊泡对小鼠肺转移的结肠癌和人类肺转移和骨转移的去势抵抗性前列腺癌有很好的效果。用纳米技术来改变肿瘤转移前微环境和抑制肿瘤生长的研究还很少。在一项最近的研究中，骨归巢聚合物纳米颗粒被用来在时间和空间上控制药物的释放（图4b）。用共轭阿仑唑奈、加载硼替佐米的聚合物纳米颗粒预处理后，小鼠表现出更慢的骨髓瘤生长速率和更长的寿命，通过理解微环境中控制肿瘤转移细胞渗透、吸附和生长的因子以及它如何实现，能够进一步发展这种用预处理来保护容易发生肿瘤转移的器官的方法。
6、临床转化中的挑战
6.1 可控和可重复的合成
确定最优的物理化学参数对治疗性纳米颗粒的成功至关重要。关于能影响有效免疫逃逸、肿瘤渗透和扩散、细胞靶向和内化、药物可控释放的单个因素的研究已经很多，然而对纳米颗粒的众多性质进行系统的平行筛选还是很困难的，由于快速、精确、可重复合成相同的纳米颗粒存在困难。与传统的体相技术相比，微流体技术由于能高速自组装尺寸分布窄、物理化学性质可调、可重复性好的纳米颗粒而受到关注。同样非润湿模板复形法能够合成尺寸、形状、化学成分、表面性质和载药能力高度可控的单分散纳米颗粒。这种方法能够帮助发现纳米颗粒，类似于小分子高产量筛选技术促进药物的发现。
6.2 评估与筛选
随着由新型生物材料或者纳米结构组成的纳米颗粒的迅速涌现，在开始动物实验前很重要的一步是在体外实验中筛选生物相容性好的纳米颗粒，体外实验也能加深我们对纳米颗粒-细胞相互作用的理解。然而由于传统的体外实验模型使用的是用多井板培养的细胞，它缺乏生物组织的复杂性和流体流动的控制，这种平台可能重复不了纳米颗粒与生物屏障之间复杂的相互影响。最近在发展仿生“器官/肿瘤芯片（organ/tumouronachip）”方面所做的能力可能克服体外实验的不足。将类肿瘤球体加入微流体通道中能够帮助我们理解间隙流动、细胞粘附、颗粒尺寸对纳米颗粒富集和扩散的影响。将纳米颗粒在这种芯片中的行为与其在动物模型的行为做对比可能帮助我们了解这些仿生微装置的潜力。
为了评估纳米颗粒在体内试验的性能（如药物动力学、生物分布、效率和安全性），必须使用动物模型。尽管有些研究表明不同纳米颗粒在不同物种间的药物动力学有一定的缩放（scaling），一个很清晰的障碍是前临床试验和临床试验结果的差异，很大程度上是因为缺少能够完全复制人类肿瘤的肿瘤模型。现在有很多种可用的动物模型，包括基于细胞系的皮下和原位异种移植、病人衍生异种移植（PDXs）、基因工程的老鼠模型（GEMMs）。然而没有单一的模型能够复制人类肿瘤的全部信息，EPR在动物模型中会比在癌症病人中更加一致。进一步考虑到肿瘤转移对死亡率的影响，肿瘤转移模型对于研究EPR和纳米颗粒穿透来说会比原发性肿瘤更加有用。纳米医疗的转化可能会大大得益于能够精确模拟人类肿瘤的异质性和解剖组织学的模型的发展，如PDXs、人类化的老鼠模型、GEMMs。
6.3 规模化生产
阻碍纳米颗粒临床发展的又一困难是从前临床到临床再到商业化的过程中，在化学、制造和控制（CMC）、好的制造实践（GMP）等方面逐渐提升的复杂性。虽然CMC和GMP的共同目标是确保产品在符合质量标准方面的一致性，但它们使用的方法和遵守的规则不同而又部分重叠。简单纳米颗粒（如脂质体）的规模化可以使用制药工业广泛使用的制造单元操作来实现，更复杂的纳米医疗对CMC和GMP提出了更高的要求，需要修改现存的单元操作或者发展新的制造过程。例子包括加入了生物的靶向配体或生物组分的纳米颗粒、同时加载几种组分的纳米颗粒、需要一层一层组装或者有多种功能（如诊断和治疗）的纳米颗粒。
通常，当纳米颗粒涉及到多步或者复杂的技术时其大规模和可重复合成会更加困难。从实验室到临床转化的过程中经常会伴随着参数的优化，甚至方法的改变，所以在早期设计纳米颗粒时考虑规模化问题至关重要。非润湿模板复形法的可重复性好，但Kg量级的生产还有待研究。同轴湍流射流混合技术是最近发展起来用于大规模（可能达到3Kg每天每通道）生产聚合物纳米颗粒的技术，它具有通常只有在微尺度混合技术（如微流体装置）中才能拥有的均匀性好、可重复性好、可调节性好等优点。虽然现在大部分的纳米颗粒还是使用体相合成法来制造，新的技术如非润湿模板复形法和同轴湍流射流混合技术能够高产量生产纳米颗粒，它们有可能加速临床转化。
7、结论
如同很多在过去几十年中变革了医学行业的科学进步一样，肿瘤纳米医疗必须先成熟起来才能发挥它的全部潜力。增进我们对肿瘤异质性的了解以及确定新的EPR标记物使得我们能够对病人做出选择以使其对纳米医疗做出最大的响应。对纳米-生物相互作用、纳米颗粒系统输运到肿瘤细胞、纳米颗粒靶向TME或者肿瘤转移前微环境的全面了解有利于实现更安全高效的纳米医疗。解决纳米颗粒在合成中遇到的可控、可重复、可规模化等难题，以及对纳米颗粒进行筛选和评估，都将有利于临床发展。虽然大多被许可的纳米医疗加载的都是现存的药物，我们期望下一代纳米医疗可以更多地加载新的分子（如激酶抑制剂）和新型治疗剂（如siRNA、mRNA和基因剪辑）。
总之，我们快速获得了对肿瘤纳米医疗所面临的机遇和挑战的更深理解。本综述探讨了将纳米技术与肿瘤生物学融合对纳米医疗发展和临床转化的重要性。我们期望纳米医疗会改变治疗肿瘤的模式，以及肿瘤纳米医疗的最终目的—极大的提高病人的存活率会在不久的将来变成现实。
文献链接：Cancer nanomedicine: progress,challenges and opportunities（Nature review cancer,2016,DOI:10.1038/nrc.2016.108）
本文由材料人生物材料组陈昭铭供稿，材料牛编辑整理。
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