Adv. Mater.：细胞转换为高效的微反应器应用于血液解毒

【引言】

成熟的红细胞（RBC）因缺乏细胞核和大部分细胞器，为血红蛋白提供了最大的空间。正因为其独特的中空结构、优异的的生物相容性和较长的血液循环时间，在生物载体方面具有独天独厚的优势，且可作为微反应器用于生物体内应用。但是，红细胞要成为一个理想的微反应器，最关键的是必须解决磷脂双分子层引起的细胞膜限定的和选择性的渗透性。

【成果简介】

最近美国国立卫生研究院Iqbal Unnisa Ali、陈小元教授和中南大学胡硕副教授（共同通讯作者）等人重整红细胞成为有效的微反应器并应用于生物医学方面。作者在低渗培养液中将解毒酶负载在红细胞上，封装之后用Triton X-100 (TX)膜穿孔试剂处理，进一步增强细胞膜的通透性，紧接着用戊二醛固定细胞，得到重整之后的红细胞（Ref-RBCs）。重整后的红细胞具有很高的通透性、容易保存且保留了原始红细胞的形状和长循环时间等优点。作者用尿酸和氰化钾作为体内和体外毒素模型研究重整红细胞这个微反应器的解毒效率，实验证明具有很高的解毒效率和毒素清除速率，且成功应用于小鼠活体研究中。该成果以“Converting Red Blood Cells to Efficient Microreactors for Blood Detoxification”为题于2016年11月28日发表在期刊Advanced Materials上。

【图文解读】

示意图1 天然的红细胞转换为生物反应器及它们在血液解毒中的应用

(a)负载解毒酶的天然红细胞通过Triton X-100和戊二醛处理转换为高渗透的微反应器。

(b)血液中的内毒素或外毒素进入重整的红细胞在负载的解毒酶作用下转化为非毒性或低
毒性的分子。

图1 蛋白负载和酶活性检测

(a)在低渗溶液中负载酶至红细胞中，再在等渗溶液中密封膜的示意图。

(b)PBS溶液浓度对红细胞摄入BSA-FITC的影响图。

(c)原始红细胞的明场显微镜成像图。

(d)红细胞负载BSA-FITC后的明场显微镜成像图。

(e)红细胞负载BSA-FITC后的共聚焦荧光显微镜成像图。

(f)红细胞负载BSA-FITC后的截面的共聚焦荧光显微镜成像图（成像图的顶部和底部来源于不同的截面。细胞膜由红色染料Dil染色；左边：FITC通道；中间：Dil通道；右边：合并图）。

(g)负载BSA-FITC的红细胞的流式细胞分析图（1.PBS溶液冲洗7次；2.Tween-20-PBS溶
液冲洗3次；0.2 × PBS溶液预处理，再孵育BSA-FITC）。

(h)HRP 催化ABTS-H2O2反应的插图。

(i)加入负载HRP的红细胞及裂解物后的ABTS-H2O2反应的紫外可见光谱图。

(j)负载HRP的红细胞及裂解物的相对催化活性图。

图2 通透化和稳定化的红细胞生物反应器

(a)TX的化学结构图。

(b)TX的浓度动力学图（在临界胶束浓度以下，TX分子为单体；当浓度达到甚至大于临界胶束浓度时，TX分子聚集形成胶团）。

(c)气孔允许底物或产物进出自由扩散同时截留酶和蛋白。

(d)Hb的结构和不同浓度的TX处理后负载Hb的红细胞上清液的紫外可见光谱图。

(e)BSA的结构和不同浓度的TX处理后负载BSA-FITC的红细胞上清液的紫外可见光谱图。

(f)TB的化学结构和不同浓度的TX预处理后的红细胞裂解液孵育TB后的紫外可见光谱图。

(g)RhB的化学结构和不同浓度的TX预处理后的红细胞裂解液孵育RhB后的紫外可见光谱图。

(h)37℃，PBS溶液中， L-RBC, L-RBC-TX, L-RBC-TX-GA 释放BSA-FITC的48h的结果图。

(i)4℃，PBS溶液中， L-RBC, L-RBC-TX, L-RBC-TX-GA 释放BSA-FITC的7d的结果图。

(j)戊二醛稳定红细胞气孔的插图。

图3 重整的红细胞的形态表征和巨噬细胞内吞分析

(a)L-RBC-TX的共聚焦荧光显微镜成像图（FITC通道）。

(b)L-RBC-TX-GA的共聚焦荧光显微镜成像图（FITC通道）。

(c)RBC的大小分布柱状图。               (d)L-RBC的大小分布柱状图。

(e)L-RBC-TX的大小分布柱状图。    (f)L-RBC-TX-GA的大小分布柱状图。

(g)L-RBC-TX 和 L-RBC-TX-GA的FITC荧光强度的流式细胞柱状图。

(h)孵育不同浓度的重整红细胞48h后的293T细胞的体外生存活力图。

(i)未处理的Raw 264.7对照组的流式细胞分析图。

(j)Raw 264.7和HRP-FITC-Ref-RBC共孵育4h的流式细胞分析图。

(k)Raw 264.7和HRP-FITC-Ref-RBC共孵育12h的流式细胞分析图。

(l)未处理的Raw 264.7及Raw 264.7和HRP-FITC-Ref-RBC共孵育4h、12h的FITC荧光强度的柱状图。

(m)未处理的Raw 264.7对照组的流式细胞分析图。

(n)Raw 264.7和HRP-FITC共孵育4h的流式细胞分析图。

(o)Raw 264.7和HRP-FITC共孵育12h的流式细胞分析图。

(p)未处理的Raw 264.7及Raw 264.7和HRP-FITC共孵育4h、12h的FITC荧光强度的柱状图。

(q)Raw 264.7细胞与HRP-FITC-Ref-RBC共孵育4h后的荧光显微镜成像图。

(r)Raw 264.7细胞与HRP-FITC 共孵育4h后的荧光显微镜成像图。

图4 Ref-RBC的原子力显微镜成像表征和力学测量

(a-c) 红细胞的二维高度形态成像图。                     (d) 红细胞的三维高度形态成像图。

(e-g) L-RBC-TX-GA的二维高度形态成像图。      (h) L-RBC-TX-GA的三维高度形态成像图。

(i) RBC 和 L-RBC-TX-GA的边缘和中心的平均高度的柱状图。

(j) RBC 和 L-RBC-TX-GA的边缘和中心的平均直径的柱状图。

(k) RBC的杨氏模量和高斯拟合曲线的柱状图。     (l) L-RBC的杨氏模量和高斯拟合曲线的柱状图。

(m) L-RBC-TX的杨氏模量和高斯拟合曲线的柱状图。

(n)L-RBC-TX-GA的杨氏模量和高斯拟合曲线的柱状图。

(o) 不同细胞的杨氏模量平均值的柱状图。           (p) 不同细胞的杨氏模量最值分布的柱状图。

图5 分子进入的速率和酶催化效率

(a)TB在不同时间段的细胞内浓度变化图。

(b)摄入TB的动力学变化图（k:扩散速率;C0:细胞外的TB浓度）。

(c)2 × PBS溶液中，不同细胞在与TB孵育不同时间段的荧光显微成像图。

(d)RhB在不同时间段的细胞内浓度变化图。

(e)摄入RhB的动力学变化图（k:扩散速率;C0:细胞外的RhB浓度）。

(f)2 × PBS溶液中，不同红细胞在与RhB孵育不同时间段的荧光显微成像图。

(g)红细胞内酶催化反应的插图。

(h)不同红细胞催化ABTS-H2O2 反应的可视化图。

(i)不同红细胞催化ABTS-H2O2 反应10min后产物的紫外可见吸收光谱图。

(j)不同红细胞相对活性的柱状图(HRP-RBC裂解物的活性设定为1)。

图6 体外解毒实验

(a)UA-HRP级联反应评估尿酸降解效率的示意图(尿酸、水和氧气在尿酸酶的作用下生成尿囊素和过氧化氢；过氧化氢在辣根过氧化物酶的作用下氧化ABTS生成有色物质(ABTS.+)；417nm的吸光度的变化值可以用于评估尿酸的降解水平)。

(b)PBS溶液中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的可视化图。

(c)PBS溶液中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的417nm处的紫外可见吸收变化图。

(d)新鲜的鼠血清中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的可视化图。

(e)新鲜的鼠血清中，Ur-Re-RBC 和Ur-RBC 催化尿酸降解的417nm处的紫外可见吸收变化图。

(f)硫氰酸酶催化反应和铁离子的比色反应评估氰化钾降解效率(KCN和S2O32−在硫氰酸酶催化下生成SCN−，SCN-与铁离子在酸性条件下形成棕色复合物；460nm的吸光度变化可以用来评估氰化钾降解水平)。

(g)PBS溶液中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化钾降解的可视化图。

(h)PBS溶液中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化钾降解的460nm处的紫外可见吸收变化图。

(i)新鲜的鼠血清中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化钾降解的可视化图。

(j)新鲜的鼠血清中，Rh-Re-RBC 和Rh-RBC 催化氰化钾降解的460nm处的紫外可见吸收变化图。

图7 药代动力学性质和Ref-RBC反应器的体内血液排毒实验

(a) Luc-Ref-RBC的血液存活图（Luc,Luc-RBC, Luc-RBC-TX, Luc-RBC-GA作为对照组）。

(b) BSA-IR-Ref-RBC在不同器官中的体内分布柱状图（BSA-IR, BSA-IR-RBC,BSA-IR-RBC-TX, BSA-IR-RBC-GA作为对照组）。

(c) BSA-IR-Ref-RBC在不同器官中的体内分布荧光成像图（BSA-IR, BSA-IR-RBC,BSA-IR-RBC-TX, BSA-IR-RBC-GA作为对照组）。

(d) 小鼠模型的体内血液解毒示意图。

(e) 中毒老鼠在Ur-Ref-RBC作用下的体内尿酸降解图（RBC, Ur-RBC, Ur-RBC-TX,Ur-RBC-GA作为对照组）。

(f) 血清中尿酸分析检测的可视化图。

【展望】

红细胞是一种天然的药物运载体，有望用于受限于细胞膜配体的靶向药物运载。可封装各种纳米颗粒、显像剂、治疗药物，为红细胞成为新型的诊疗一体化平台提供广阔的前景。

文献链接：Converting Red Blood Cells to Efficient Microreactors for Blood Detoxification (Adv. Mater., 2016, DOI: 10.1002/adma.201603673)

本文由材料人生物材料组邓宏华供稿，材料牛编辑整理。

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