Nature Nanotech. 美国圣母大学成功利用亚纳米孔读取蛋白质一级结构分辨度达0.07nm3

引语：蛋白质测序是研究蛋白质不可回避的问题之一。近日，美国印第安纳州，圣母大学的Gregory Timp教授在蛋白质测序工作中获得新进展。

蛋白质的一级结构包含有氨基酸序列，这是决定蛋白质如何折叠以及具有怎样功能的关键因素。然而，诸如质谱法、埃德曼降解法等传统的蛋白质测序方法，都受制于短序列和低灵敏性等，所以人们一直在寻找更有效的办法。作者报导了一种通过氮化硅薄膜溅射而得的直径在亚纳米级别的孔，能够用来检测变性蛋白质分子的一级结构。在电解质中变性蛋白分子在电场驱动下通过这种亚纳米孔，测得的电流阻塞显示了近乎规律的波动，其数量与蛋白质残基的数量一致。此外，波动的振幅，与蛋白质一级结构中四残基的阻塞体积相关性很高。因此，每一个波动都表示对四残基的读取，这就说明亚纳米孔对读取阻塞体积是足够灵敏的，其中阻塞体积与单个残基转译后的修饰相关，测量体积差异为0.07立方纳米，但其灵敏度还无法达到识别全部的20种氨基酸之间的阻塞体积。

图1 使用亚纳米孔检测单蛋白质分子

a-c, 公称直径为0.7nm(a)，0.5nm(b)，0.3nm(c)的亚纳米孔的（i）TEM照片，（ii）多层模拟，（iii）2D投影，（iv）3D描述示意图。亚纳米孔通过由10nm厚的氮化硅薄膜溅射而得。散粒噪音与穿过孔的电子转移相关。
d, 连续的电流示踪图像。结果表明持续和部分阻塞电流与1V时穿过孔的CCL5的单个分子的移位相关。高电压会导致更大的阻塞电流。
e, 通过孔的蛋白质分子移位的原理示意图。改性剂使得蛋白质带上一致的负电荷使其形成了杆状结构。
f-h, 热点图描述了部分阻塞的分布特征。图中展示了开孔电流（ΔI/I0）与阻塞持续时间（Δt）的关系，与通过孔的变性CCL5移位相关，横截面f -1.4 × 1.6 nm2, g-1.4 × 1.6 nm2, h-0.3 × 0.3 nm2。白色轮廓线表示该区域包含50%的阻塞。
i, 对应于f，热点图显示了阻塞电流分布，与通过孔的变性的BSA移位相关。这种分布很容易与CCL5区分，因为能量间隔较大，为Δ=1.6 ×10-4。
j,k, 阻塞分布的热点图，分别描述了与之相关的通过孔的变性H3N和H3A移位。这些分布难以被区分，因为其能量间隔只有Δ=3.8 ×10-5。

图2 使用亚纳米孔检测单蛋白质分子中的氨基酸

a, 与通过亚纳米孔的单CCL5分子的移位相关的阻塞电流中的有单阻塞产生的几乎规律化的波动的部分展开放大图（数据为图1d的前一部分）。这种波动来自于一次进（或出）亚纳米孔的独立的残基。
b-d, 与a对应，曲线为几乎规律化波动曲线的部分展开放大图，其数量在成熟的CXCL1(b)，BSA(c)，H3N(d)中的通过亚纳米孔的AAs数量相关。图像曲线用高斯分布拟合。
e, 对阻塞和不同的持续时间警醒傅里叶分析得到波动数量，使用的是与a-d中相同的四种蛋白质。计数与阻塞持续时间独立，但依赖于蛋白中残基的数量。（注：AAs，原文中amino acids的首字母缩写，即氨基酸。）

图3 蛋白质序列分析

a, 通过横截面为0.5×0.6nm2孔（红色）的CCL5的400-阻塞共有序列，与阻塞提及模型（设k=3，蓝色）和单一高关联结果（C=0.69，蓝色）。曲线上方的误差图标明了读取结果的保真度。标明正确或错误读取的灰度误差图在下方给出，灰色代表正确读取，黑色表明是错误读取。CCL5的正确读取百分比为65.2%。
b, 对应于a，为通过孔的CXCL1的45-阻塞序列。尽管阻塞数量较低，但从下面的误差图来看，其读取的保真度提高了，对CXCL1的正确读取百分比为84.7%。
c, 对应于a，为通过孔的H3N5的52阻塞序列。其正确读取百分比为90%。
d-f, 不同残基的体积误差。d-CXCL1，e-CCL5，f-H3N。
g, 部分平均读取误差与CXCL1、CCL5、H3N中残基的体积的函数关系。较小的AAs是误差的主要来源。虚线为数据进行最小二乘法拟合所得，方便读者观察。

图4 亚纳米孔对分子体积的灵敏度测试

a, 182-阻塞序列，与阻塞体积模型（假设k=4，黑色）和单阻塞（蓝色）并列。插图：从阻塞和E20的不同持续时间所得的波动数量。尽管平均数（N-E20=22.5）与阻塞持续时间相独立，但不精确。
b, 与a对应，是通过横截面0.4×0.5nm2（红色）亚纳米孔的嵌段共聚物R-G的58-阻塞序列，与阻塞体积模型（假设k=4，黑色）和单一高相关阻塞（C=0.90和0.96，蓝色）。
c,d, 单位点化学改性对组织蛋白H3尾肽在阻塞波动振幅的影响。原始H3N（浅蓝）和K9-酰化的H3A（图4c中深蓝色，231-阻塞，放大到原始H3）和K9-甲基化的H3M（图4d中深蓝色，958阻塞体积，放大到原始H3N）的序列形成，并列在相同曲线上再比较。可以观察到，波动的振幅在位置6和11之间得到增强，表明此处有增加的阻塞体积。下方是原始序列和修饰后的序列间的差异轨迹（灰色）在与H3A/H3M相关的部分阻塞（黑色虚线）中表现出显著的“顶帽状”增加。

小结：作者在扫描透射式电子显微镜（STEM）中利用电子束诱导溅射在氮化硅薄膜中制备出亚纳米级微孔，其直径小于 α-螺旋的尺寸，从而大大提高了化学特异性。作者利用这种亚纳米级的孔洞进行蛋白质测序。作者发现，阻塞电流与通过亚纳米孔的单变性蛋白的移位相关，电流的波动会造成对蛋白一级结构读取的低保真度。对于应用于DNA的纳米孔定序器，低保真度的读取和能够影响阻塞电流的多重单体并没有对蛋白质测序造成不可避免的问题，有一种算法适用于解码AA序列。然而，亚纳米孔灵敏度任然是一个开放性问题。当序列足够大时，读取会足够灵敏来在单一残基上测试PTMs，但灵敏度还不足以达到所有AAs彼此之间的识别。

注：α-螺旋，是在蛋白质中发现的常见的二级结构，其大小与水合离子尺寸相当，其直径小于0.5nm，每增加一个残基大小增加0.15nm。

原文链接：Reading the primary structure of a protein with 0.07 nm3 resolution using a subnanometre-diameter pore  Nature Nanotechnology， 2016， DOI: 10.1038/NNANO.2016.120

本文由编辑部提供素材，李卓整理编译。

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