IgG活性的文章
近日，天美健生物科研团在Microchemical Journal上发表了最新研究成果。《Microchemical Journal》（中科院分区2区，2024年最新影响因子为4.9）上发表题为 “A Novel Approach for Detecting Immunoglobulin G Activity through Charge Interactions” 的研究性论文。基于电荷相互作用的免疫球蛋白G活性检测新方法：全面综述——天美健生物科研实力彰显，为营养医学领域注入新活力。
图文摘要
成果亮点
- 通过配体结合过程中的聚集行为评估IgG的活性与稳定性
- IgG活性的评估聚焦于电荷相互作用，而非直接抗原结合
- 采用分光光度法、沉淀重量法和比色法检测IgG活性
研究背景
免疫球蛋白G（IgG）是人类和动物免疫反应中的关键抗体，其中牛初乳的IgG含量尤为丰富，可达50-100g/L。IgG在识别和中和病原体（如细菌、病毒和毒素）方面发挥着核心作用。鉴于其在免疫防御中的重要性，准确检测IgG含量和活性至关重要，特别是在治疗学和营养学领域——这些领域常利用牛初乳的免疫益处。然而，几乎所有乳粉制品和乳制品补充剂都需经过高温加工处理，如热干燥、热灭菌甚至辐照。这些加工过程往往导致蛋白质活性丧失，因为热处理可能破坏对温度敏感的生物活性成分。这种处理会影响包括免疫球蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、生长因子、酶类、乳铁蛋白、白蛋白等多种关键蛋白质和生物分子，从而可能降低其功能特性和整体功效。
IgG的活性受多种因素影响，包括温度、pH值和酶解作用。IgG对温度变化极为敏感，过高或过低的温度都会导致蛋白质变性，从而降低其有效结合抗原的能力。保持适宜的温度范围对维持IgG的结构和功能至关重要。同样，pH值水平也会显著影响IgG活性——偏离最佳pH值（通常接近中性）可能改变抗体的构象，削弱其抗原结合能力。而酶解作用（通常由纤溶酶等蛋白水解酶引发）会将IgG分解为更小的片段，进一步降低其免疫活性。目前评估IgG活性的常规方法（如酶联免疫吸附试验（ELISA）和比浊法）虽被广泛采用，但在某些应用中可能存在特定局限性。这些方法通常耗时较长，需要专用设备且成本较高。此外，IgG对温度、pH值等环境因素的敏感性，可能影响检测结果的可靠性和重复性，使其在大规模或常规检测中实用性受限。更值得注意的是，样品制备过程中的酶解作用可能导致IgG活性检测结果出现偏差。当前亟需开发更高效、更具成本效益的改进方法，这些方法需能在不同条件下保持检测的准确性与灵敏度。新型检测技术旨在简化检测流程，同时克服传统检测方法面临的挑战，最终实现更实用、可扩展的IgG活性评估。本研究开发的方法为IgG活性测定提供了安全稳定的技术框架。通过分析IgG中可电离氨基酸（IACs）的行为特征，监测净电荷和等电点（pI）的变化，该方法在可控pH值和离子强度条件下，通过IgG聚集-分散动态变化来推断其活性。这种基于电荷特性的检测方式能够实现安全、可扩展的精准活性评估，适用于各类实验室和工业环境。与传统方法相比，该技术避免了基于病原体的检测方法所带来的操作复杂性和潜在生物危害风险，为科研与生产领域的广泛应用提供了技术支持。
方法原理
通过分析IgG的净电荷和等电点(pI)来评估其活性。关键IACs（如天冬氨酸Asp、赖氨酸Lys、精氨酸Arg和组氨酸His）会随pH值变化发生质子化/去质子化，从而改变IgG的电荷特性（图1）。Fab区（抗原结合片段）中的IACs可调节局部电荷环境，影响抗原抗体结合的特异性；Fc区（可结晶片段）的IACs则维持结构稳定性，介导效应功能。当pH接近pI时，IgG净电荷最小化，导致聚集倾向增强。
图1. 净电荷与等电点对IgG沉淀特性、结合活性及功能性质的影响
本技术（专利号：CN202411560355.6/CN119394942A）创新性地开发了一种基于IgG分子可电离氨基酸（IACs）的新型活性检测方法。通过精准调控pH和离子强度条件，实时监测IgG分子聚集-分散动态变化及电荷特性改变，该方法利用电荷相互作用和配体结合机制，实现了无需直接接触抗原/病原体即可准确评估IgG活性的技术突破。这一创新方法不仅避免了传统检测中的生物安全风险，更为抗体药物研发和质量控制提供了全新的解决方案，具有广阔的应用前景。
使用分光光度法作为首选方法检测IgG的活性。IgG在75℃下分别加热0、5、15、30、60 min，结果如图2所示。75℃加热0和5 min不影响IgG的活性（19.4U/mL），说明IgG在此阶段保持稳定和活性。然而，当加热15 min时，IgG的活性明显下降，表明IgG开始因加热而失去其功能特性。随着加热时间延长至30 min和60 min， IgG活性进一步降低（0.2 U/mL），在60 min时几乎完全失去活性。活性的丧失可能是由于IgG分子的变性造成的。
图2. pH和温度条件下比色法配体结合试验对IgG活性的测定
此外，研究了加热时间对IgG活性的影响及其与加热后添加的花青素-3-半乳糖苷或β-胡萝卜素指示剂的相互作用，揭示不同加热时间的IgG（%）活性。在0 min时，IgG活性最高（93 %），随着加热时间的增加，IgG活性逐渐降低。结果表明，IgG活性在加热时间段内有显著变化，15 min后显著下降（69 %），在60 min时几乎完全失活（31 %）。图2显示了加入花青素-3-半乳糖苷或β-胡萝卜素指示剂后IgG溶液的视觉变化。花青素、类胡萝卜素、姜黄素、茜素、甜菜素、叶绿素和藻蓝蛋白等指示剂在其净电荷位点与IgG结合，导致颜色变化，反映了IgG的剩余活性。花青素-3-半乳糖苷或β-胡萝卜素与这些电荷位点相互作用，可以监测IgG的电荷谱变化并推断其活性。例如，在pI附近，IgG的净电荷减少导致聚集，可以通过指示剂结合或比色响应的变化来检测。花青素-3-半乳糖苷显示出强烈的颜色变化（在酸性条件下为红色），为IgG活性提供视觉和分光光度信号。该方法能快速、灵敏地检测IgG的电荷依赖行为，不需要复杂的仪器。在0和5 min时，溶液表现出强烈的着色，表明IgG结构完整，配体有效结合。随着加热时间的增加，颜色逐渐褪色；在15 min时，IgG活性部分丧失，而在30和60 min时，溶液几乎无色，表明IgG变性和指示剂结合位点的丧失。这突出了加热对IgG结构的影响及其与花青素-3-半乳糖苷或β-胡萝卜素指示剂相互作用的能力。
图3. 基于火箭免疫电泳、放射免疫扩散和等电点的IgG结合活性检测
此外，本研究还采用紫外吸收光谱法对IgG的活性进行评价。图3为pH值为3、6和7时IgG电荷和活性的分析，揭示了不同条件下吸光度的显著差异。pH值为3-6时，在250-280nm、280-310nm和大于310nm波长范围内，吸光度分别下降77%、84%和95%。在pH6和7之间观察到类似现象，强调了该方法在评估IgG活性方面的有效性。
在火箭免疫电泳和免疫扩散中使用抗血清验证了该方法检测IgG活性的能力，火箭峰和沉淀圈是IgG-抗血清相互作用的特异性区域。火箭免疫电泳分析、免疫扩散测定和 SDS-PAGE 分别对不同加热时间的 IgG 样品进行了检测。如图3所示，火箭免疫电泳峰高的降低和免疫扩散沉淀圈直径的减小直接反映了热处理后IgG抗原结合能力的下降。在0和5 min时，高峰和宽带表明IgG结构保存完好，抗原结合能力强。在15 min时，峰高和沉淀圈大小明显减小，表明部分变性和活性丧失。15 min后，峰和沉淀圈很小或不存在，表明IgG广泛变性、聚集，几乎完全丧失抗原结合能力。该变化与IgG的Fab区（包含抗原结合位点）的破坏以及IgG分子的聚集和分裂直接相关。
在pI处，IgG净电荷为零，溶解度最小，沉淀增加，表明溶解度和功能活性之间存在相关性。沉淀通常在pI附近的pH范围内观察到，反映了蛋白质溶解度和活性之间的关系。蛋白质电荷、IACs状态和与pI的接近度等关键因素，在维持IgG的稳定性和功能方面起着至关重要的作用。当IgG接近其pI时，溶解度降低，促进聚集，从而破坏结构完整性并损害抗原结合能力。Fab区的NH2基团，特别是CDRs中的NH2基团，通过与抗原形成氢键和静电相互作用，在抗原结合中起着关键作用。在pI时，由于IACs的平衡质子化，包括NH2基团(例如赖氨酸和精氨酸侧链)，IgG的净电荷最小。这种净电荷的减少降低了IgG分子之间的静电斥力，导致聚集和沉淀。
因此，NH2基团直接受到pH变化和IgG的pI的影响。当pH值低于pI时，NH2基团被质子化（NH2+），带正净电荷。在pH值高于pI时，NH2基团被去质子化（NH2），导致中性或负净电荷。在pI附近，NH2基团的质子化状态与其他可电离残基（例如羧基）平衡，导致最小净电荷和聚集增加。该方法的多功能性支持诊断、乳制品加工和生物制药的应用，确保IgG在工业和临床环境中的功能。通过结合结构分析、电荷动力学和功能分析，提出一个可扩展的框架来保护蛋白质的完整性，增强不同背景下的质量控制。
结论
本研究提出了一种新的基于电荷的IgG活性检测方法，与传统的抗原依赖性测定方法相比，该方法具有显著优势，揭示了IgG的pI与其抗原结合能力之间的显著关系。通过分析IACs和电荷相互作用，该方法提供了一种直接评估蛋白质活性的方法，无需特异性抗体或抗原，从而降低成本和复杂性。该方法通过整合不同的底物指标，对各种蛋白质的适应性进一步提高了其通用性。即使在热诱导变性条件下，IgG 活性检测的成功演示也突出了该方法的稳健性。该方法具有显著影响多个领域的潜力，包括诊断、乳制品和乳制品补充剂，其中快速和经济高效的蛋白质活性评估至关重要；治疗监测，其中精确定量功能性抗体至关重要；以及生物制药或乳制品行业的质量控制，保持蛋白质的完整性至关重要。其固有的可扩展性和与不同指标系统的兼容性使其成为推进蛋白质检测技术的有前景的工具。
团队负责人：Dr. Fawze Alnadari 纳萨尔，博士，研究员。江苏省功能蛋白工程技术研究中心实验室负责人，初乳和鱼胶原蛋白肽营养成分研究专家，萨那大学食品科学与营养院系辅导员， Frontiers in Nutrition特邀编辑， 近五年来发表了30多篇代表性科研论文，发明6项专利（排名第一），三次在南京农业大学国际学生中获得品学兼优奖。
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