学术干货 | 荧光，你所知道与所不知道的（附带荧光测试必备小知识）

引子

谈及荧光，小编的脑海中首先浮现出一位男神——钱永健先生。因为其在绿色荧光蛋白方面的突破性研究，钱永健先生与其他两位科学家共同分享了2008年的诺贝尔化学奖。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是一种在当今生命科学和医学研究中被广泛使用的示踪物。它的出现彻底改变了科研人员的实验策略，基于GFP的光学成像技术使人们可以直接观察到从微观到宏观各个层次上丰富多彩的生命现象。

从绿色荧光蛋白的广泛应用，我们很容易感受到荧光的魔力，下面小编就和大家聊一聊荧光这种神奇的现象。

一张图回顾荧光基本原理

荧光的基本原理较为简单，相信大家在本科阶段的课程里已经有所接触。以下通过一张简单的图片带大家回顾一下荧光的基础知识（学霸们跳过就好……）。

荧光的基本应用

生物探针

上图显示的是通过荧光能量共振转移（FRET）现象，标记生物基因的表达过程。图中的目标基因在没有表达的时候，标记在不同RNA分支上的供体染料和受体染料因为淬灭剂的存在不会发光，而当细胞受到刺激，相应的基因开始表达时，转录出来的RNA会与改造后的RNA相接处，进而使得染料发光。（Santangelo PJ, Nix B, Tsourkas A, Bao G. 2004. Dual FRET molecularbeacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res32(6):e57.）

设计出合理的探针，对于研究生物体系中的化学反应过程是十分重要的事情。

发光材料

家喻户晓的LED（发光二极管）基本原理就是电致荧光现象。发光二极管与普通二极管一样是由一个PN结组成，也具有单向导电性。当给发光二极管加上正向电压后，从P区注入到N区的空穴和由N区注入到P区的电子，在PN结附近数微米内分别与N区的电子和P区的空穴复合，产生自发辐射的荧光。而通常使用的日光灯的基本原理是光致发光。利用汞激发之后发射紫外线激发灯光中的荧光粉发出可将光进行照明。而五颜六色的荧光棒这是通过化学能激发荧光分子发光。可见发光的机理多种多样，而正是如此，才让我们的夜晚更加五彩斑斓。

医学成像

这一块小编不是很了解，只是觉得图中这个组织被荧光物质染色的小老鼠是活不长了……（Weissleder R, Ntziachristos V. 2003. Shedding light onto live moleculartargets. Nature Med 9(1):123–128.）

单分子检测

单分子荧光检测在化学分析、纳米材料分析、医学诊断、法医分析、生物材料研究等方面都具有独特的应用价值，对许多学科领域的发展产生了和正在产生着深远的影响。而去年获得诺贝尔化学奖的超分辨荧光显微技术在该领域有着十分重要的应用。

稀土发光材料

相比于有机分子，荧光稀土元素在荧光性质方面具有很大的优势，如色度纯高、寿命长等优点。从上图某含稀土铕元素的样品的荧光发射光谱中可以看出，该样品的荧光发射峰较窄，这正是其色纯度高的体现。而合理设计稀土元素的组成，还可以合成出上转化发光材料。上转换材料是一种红外光激发下能发出可见光的发光材料,即将红外光转换成可见光的材料，这也是是所谓夜视镜的基本原理。（Tang, S.; Babai, A.; Mudring, A. V.2008. Europium-based ionic liquids as luminescent soft materials. Angew. Chem., Int. Ed 47 (40)：7631-7634.）

荧光测试必备小知识

• 对于未知样品，建议大家先测一下样品的吸收谱，并从中找出感兴趣的吸收峰和特性，在荧光测试（激发和发射光谱测试）时以便参考。
• 发射光谱：根据吸收谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。
• 激发光谱：根据发射谱中感兴趣的峰确定发射波长，选择合适的激发谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行激发谱的扫描。
• 滤光片的选择：发射谱扫描过程中，通常选择比激发波长长，比发射谱最短波长短的长波通型截止滤光片。激发谱扫描过程中，通常选择比发射波长短，比激发谱最长波长长的长波通型截止滤光片。
• 狭缝的选择：如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，损伤仪器；如果狭缝开的太小，荧光信号又太弱，检测比较困难，所以要选择大小合适的狭缝。
• 扫描速度的选择：如果扫描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信号；扫描太慢则浪费时间。所以只要能扫描得到平滑的光谱曲线就可以了。

参考资料：

[1] Joseph R. Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition.

[2] Santangelo PJ, Nix B, Tsourkas A, Bao G. 2004. Dual FRET molecularbeacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res32(6):e57.

[3] Weissleder R, Ntziachristos V. 2003. Shedding light onto live moleculartargets. Nature Med 9(1):123–128.

[4] Tang, S.; Babai, A.; Mudring, A. V.2008. Europium-based ionic liquids as luminescent soft materials. Angew. Chem., Int. Ed 47 (40)：7631-7634.

本文由材料人编辑部何鑫供稿，材料牛编辑整理。

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