Adv. Mater.：将sp2碳共价有机框架上的单原子活性位点设计为诱导细菌类铁死亡现象，以实现强效的抗感染治疗

一、【导读】

抗菌药物耐药性严重影响了传统化疗方案，并持续成为全球性的健康问题。细菌可以采用各种策略来避免传统抗生素治疗中对生长的抑制，包括酶失活和靶点修饰。此外，它们还可以通过重新编程宿主代谢、干扰降解途径和抑制免疫细胞的方式引发后抗生素扩张和复发/持续感染。因此，寻找能够规避抗生素耐药性的替代策略至关重要。

铁死亡是一种依赖于铁离子和脂质过氧化的细胞死亡形式，已在多个生物学背景下被发现，涉及发育、衰老、免疫和癌症等方面。迄今已经描述了多种诱导铁死亡的策略，包括铁传递、系统Xc⁻的抑制、谷胱甘肽（GSH）耗竭和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的抑制。最终导致铁死亡的精确机制可能涉及对细胞膜完整性的破坏，通过脂质交联来破坏膜性质，并进一步由多不饱和脂肪酸链产生的活性氧自由基（ROS）对大分子和细胞结构造成氧化损伤。有人假设，调控铁死亡的经典调控途径中的关键分子可能是克服药物耐药性的潜在途径。

新兴的基于铁的纳米材料，包括铁氧钐、纳米铁硫化物和铁有机框架，已被应用作为诱导铁死亡的催化剂，其中Fe²⁺推动了Fenton反应。例如，已经尝试将铁离子引入亚稳态的Fe₃S₄（格雷吉特）或FeSO₄中，以促进铁超载引发的GSH消耗，从而导致细菌类似铁死亡的发生。基于铁铁氧化物的纳米组装体也被用作诱导细菌类似铁死亡的催化剂，通过引发细胞内铁超载和干扰铁代谢。

然而，目前用于诱导细菌类似铁死亡的基于铁的纳米材料仍然不尽人意，通常需要非常高的铁剂量或辅助成分才能达到协同效应。另外，直接传递铁物质可能会对正常组织产生有害影响，如神经毒性、氧化应激和过敏反应。单原子催化剂（SACs）近年来在化学催化领域成为令人兴奋的前沿技术，因其精确确定的活性中心、稳定的催化性能和高稳定性。SACs可以被看作是在原子层面上精确设计纳米催化材料的极限。特别是，它们已被用作仿生纳米酶，模拟自然酶的结构和优异的催化能力，有效产生过量的ROS来抑制细菌或肿瘤。例如，Qu等人报道了一种自适应的基于铁的SAC，加速选择性和安全的铁死亡；一种非铁基的Pd-SAC模拟了双过氧化酶（POD）和谷胱甘肽氧化酶（GSHO_x）的活性，也有效诱导了通过上调LPO和ROS表征的铁死亡。不幸的是，考虑到细菌细胞内H₂O₂水平较低，单独的Fenton反应难以产生足够的ROS，这削弱了传统SACs的催化治疗效果。

最近，将孤立的活性金属中心固定在固体支撑上代表了光化学领域的创新突破。由合适的构建基元和有机功能基团组成的纳米尺度共价有机框架（COFs）因其可调节的微观结构和光电性质而成为非常有前景的载体，优于传统的催化剂支撑材料。探索利用COFs作为支撑材料构建SACs以满足铁死亡需求的可能性已经被研究。各种单原子金属中心固定在COFs上可以呈现出有效的光催化作用。许多研究证明，Ir和Ru等过渡金属元素可以作为单原子活性位点，而不破坏框架结构，用于构建高性能光化学催化剂。向裸露的光催化剂中加入单个过渡金属原子可以扩展光响应范围，缩短电子传输距离，并通过增加共享效应来形成稳定的中间态配置，赋予SACs出色的光催化性能。因此，探索基于COF的SAC范式作为细菌类铁死亡诱导剂极具前景。

二、【成果掠影】

鉴于此，南京师范大学化学与材料科学学院的周宁琳团队制备了两种单原子过渡金属位点（如Ir和Ru），将它们锚定在sp²c连接的COF（sp²c-COF）骨架上，形成具有金-氮-碳桥连结构的体系。通过Schiff碱反应中的共价相互作用，可以涂覆甲氧基聚乙二醇胺（mPEG-NH₂-4000）聚合物，以产生亲水性和高生物相容性的SACs（sp²c-COF-Ir-ppy₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂）。实验结果和密度泛函理论（DFT）计算表明，Ir和Ru SACs的优异光催化能力和POD活性归因于COF的固有多孔性质以及原子分散金属中心与sp²c-COF宿主之间的协同效应。

在照射下，Ir和Ru活性位点可以产生超阈值的ROS，消耗细胞内的GSH，干扰呼吸链和代谢过程，从而促进不可逆的LPO驱动的类铁死亡通路。这两种诱导剂显示出低溶血和细胞毒性，对多种细菌、耐药细菌具有强大的抗菌活性，并对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的创伤和脓肿感染具有强大的治疗和预防潜力。总体而言，我们进行了一项概念验证研究，发现COF基SAC作为抗菌的类铁死亡启动剂以消除感染。相关研究成果以“Designing Single-Atom Active Sites on sp²-Carbon LinkedCovalent Organic Frameworks to Induce Bacterial Ferroptosis-Like for Robust Anti-Infection Therapy”为题，发表在顶级期刊Advanced Materials上。

三、【核心创新点】

引入非铁金属单原子催化剂（Ir和Ru SACs）作为新型的细菌类似铁死亡策略

四、【数据概览】图1 描述了在sp²c-COF孔中进行Ir和Ru SACs的协同合成的方案©2023 The Authors

图2 sp²c-COF的表征结果。a) BTHAN和TA的最高占据轨道和最低未占据轨道。b) 非穿插式sp²c-COF的扩展结构。c) sp²c-COF重复单元的静电势表面显示可能的活性位点。d) sp²c-COF的电荷密度差异，包括放大的顶部和侧面视图，品红和黄色分别表示电子积累和耗竭。e) sp²c-COF片段在激发态的空穴和电子分布热图。f) 由于sp²c-COF的局部极化产生的偶极矩方向。g) sp²c-COF在激发态的电子-空穴分布，蓝色和绿色分别表示电子积累和耗竭。h) sp²c-COF的Pawley精化结果：实验XRD图案显示为黑色，Pawley精化图案为红色，二者差异为蓝色，使用AA堆积模式的模拟图案为绿色。i) sp²c-COF的AA堆积模型晶体结构。j) sp²c-COF在77K下的氮气吸附-脱附等温线。插图：通过将NLDFT模型拟合到吸附数据来计算的孔径分布。k) AA堆积的sp²c-COF的模拟孔径大小。l,m) sp²c-COF的AFM图像及其三维地形图像。n,o) sp²c-COF的表面电位图像及其三维电位线剖面图  © 2023 The Authors

图3  Ir和Ru SACs的形态。a) sp²c-COF-Ir-ppy₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂的合成路线。b-d) b) sp²c-COF，c) sp²c-COF-Ir-ppy₂，d) sp²c-COF-Ru-bpy₂的FESEM图像。e-g) e) sp²c-COF，f) sp²c-COF-Ir-ppy₂，g) sp²c-COF-Ru-bpy₂的TEM和HRTEM图像。h-j) h) sp²c-COF，i) sp²c-COF-Ir-ppy₂，j) sp²c-COF-Ru-bpy₂中选择区域的C、N、Ir和Ru元素的TEM-EDX映射图像（暗场模式）。k-m) k) sp²c-COF，l) sp²c-C © 2023 The Authors

图4  Ir和Ru SACsOF-Ir-ppy₂，m) sp²c-COF-Ru-bpy₂的SAC-HAADF-STEM图像。的结构。a,b) sp²c-COF-Ir-ppy₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂的标准化Ir L3边缘XANES谱图。c,d) sp²c-COF-Ir-ppy₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂的FTEXAFS谱图。e,f) sp²c-COF-Ir-ppy₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂的WT谱图。g,h) sp²c-COF-Ir-ppy₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂的EXAFS拟合曲线（k空间）© 2023 The Authors

图5 光催化ROS产生。a-c) 在(a) sp²c-COF，(b) sp²c-COF-Ir-ppy₂和(c) sp²c-COF-Ru-bpy₂上记录的TMB氧化的UV-vis吸收光谱。d) sp²c -COF，sp²c -COF-Ir-ppy₂和sp²c -COF-Ru-bpy₂上DHE探针的荧光发射光谱。e) sp²c -COF，sp²c -COF-Ir-ppy₂和sp²c -COF-Ru-bpy₂上DPBF的降解。数据表示为平均值±标准差；n = 3。f) sp²c -COF，sp²c -COF-Ir-ppy₂和sp²c -COF-Ru-bpy₂的能带结构。g-i) 不同处理条件下sp²c -COF，sp²c -COF-Ir-ppy₂和sp²c -COF-Ru-bpy₂的ESR光谱。j) 三种COFs的分子轨道图 © 2023 The Authors

图6  人体外类铁死现象。a) 菌落形成单位（CFU）计数，b) 扫描电子显微镜（SEM）图像（刻度尺=1 μm），c) E. coli和S. aureus细胞在不同配方处理下的细胞内ROS水平：(I) PBS，(II) sp²c-COF，(III) sp²c -COF-Ir-ppy₂，(IV) sp²c -COF-Ru-bpy₂，(V) sp²c -COF+激光，(VI) sp²c -COF-Ir-ppy₂+ H₂O₂+激光，(VII) sp²c -COF-Ru-bpy₂+激光。d,e) 在红光照射下，E. coli和S. aureus细胞在PBS，sp²c-COF-Ir-ppy₂+ H₂O₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂处理后的透射电子显微镜（TEM）图像。刻度尺=500 nm。f) C11-BODIPY染料染色的E. coli和S. aureus细胞在红光照射下经PBS，sp²c-COF-Ir-ppy₂+ H₂O₂和sp²c-COF-Ru-bpy₂处理后的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。刻度尺=5 μm。g) E. coli细胞中GPX4蛋白质的Western blot分析，具有不同条件。数据表示平均值±标准差；n = 3。h) E. coli细胞的细胞内GSH，i) TrxR，j) 和ATP水平，在I，V，VI，VII组。数据表示平均值±标准差；n = 3。k)细胞膜损伤中使用的LPO的示意图。使用一方差分析（ANOVA）检验进行统计显著性检验，使用Bonferroni的比较检验，给出P值，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01 © 2023 The Authors

图7  MRSA转录组的变化。a) 与Ctrl组相比，Ir SAC组和b) Ru SAC组中差异表达基因（DEGs）的火山图。c,d) 在(a) Ir SAC和(b) Ru SAC与Ctrl组相比，上调和下调的基因本体富集分析。e,f) Ctrl、Ir SAC和Ru SAC的脂质转运与代谢、细胞壁/膜/包膜生物合成、能量生产与转换以及复制、重组和修复的表达变化。数据表示为log₂折叠变化；n = 3。g) 基于转录组分析的Ir和Ru SAC介导的细菌类铁死样机制的示意图。使用一方差分析（ANOVA）检验进行统计显著性检验，使用Bonferroni的比较检验，给出P值，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01 © 2023 The Authors

图 8  人体类铁死现象。a) 基于COF的SACs诱导的细菌类铁死样评估的示意图。b)接受不同处理的残余伤口面积的定量分析。c) 第3天和第12天使用稀释涂布法测量感染伤口周围的细菌负荷。d) 包含DAPI、DCFH-DA和C11-BODIPY的伤口组织切片。比例尺=100 μm。e) 不同COF处理后伤口部位Ki67标记的阳性细胞的组织化学染色图像。比例尺=100 μm。f) 第12天感染皮肤切片的H&E和Masson染色。比例尺=200 μm。i）它们在红光照射或存在H₂O₂的条件下表现出高效的ROS产生能力，这是由于它们较窄的带隙和类过氧化物酶的纳米酶活性 © 2023 The Authors

图 9  人体脓肿愈合评估。a) 描述MRSA感染脓肿模型中的治疗方案的示意图。b) 不同时间点感染脓肿的各组代表性图像（比例尺=10 mm）。c) 在12天治疗过程中残余病变面积的统计图。数据表示为平均值±标准差；n = 3。d) 第3天和第12天感染皮肤组织中MRSA的CFU。数据表示为平均值±标准差；n = 3。e) 第12天病变部位的Wright染色。f) 不同治疗后第12天病变部位的TNF-𝛼、CD80、CD163染色的免疫组织化学和免疫荧光图像。比例尺=100 μm。g) B细胞（CD¹⁹⁺/CD²¹⁺/CD⁴⁵⁺）的流式细胞术。h) TNF-𝛼阳性区域的平均荧光强度的定量化。i–j) CD80和CD163阳性区域的平均荧光强度的定量化。k) 来自(g)的B细胞百分比计算。数据表示为平均值±标准差；n = 3。统计学显著性由一元方差分析检验和Bonferroni的比较检验确定，给出P值，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01 © 2023 The Authors

图10 通过细菌类似铁死亡、炎症相早期终止、促进血管生成和免疫激活途径的治疗机制示意图 © 2023 The Authors

五、【成果启示】

总结起来，我们提出了一种非铁的细菌类似铁死亡策略。与传统的铁基诱导剂相比，具有金属-氮-碳桥接结构的高效Ir和Ru单原子催化剂具有以下几个优点：

i）它们可以作为有利的GSH氧化物模拟纳米酶，增强内源性GSH的耗竭，从而抑制GPX4酶的活性和降低TrxR水平，进而破坏抗氧化系统并进一步积累脂质过氧化物（LPO）。

ii）它们可以严重破坏细菌的代谢能力和正常呼吸，将有氧呼吸转变为厌氧呼吸。

iii）它们引起严重的氧化应激，导致细菌基因系统和蛋白质脂酰化的损坏。在照射下，Ir和Ru SACs在革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、临床分离的MRSA上显示出有效的抗菌活性，并且能够破坏生物膜。这两种类似铁死亡的诱导剂在体外和体内都显示出低毒性，表明在潜在的临床应用中具有出色的生物安全性。

最后，应用Ir和Ru SACs不仅显著加速了MRSA感染的创伤和脓肿的愈合过程，还诱导了特定病原体的免疫记忆反应，降低了再感染的风险。总体而言，我们的研究首次创新地介绍并验证了基于COF的非铁细菌类似铁死亡策略，为未来的抗感染治疗提供了有希望的方向。

原文详情：

Local inversion-symmetry breaking in a bismuthate high-Tc superconductor https://doi.org/10.1038/s41467-023-36348-9

本文由Andy供稿。