北清联手Nat Methods：超平整石墨烯制备均匀的薄冰用于高分辨率冷冻电镜结构分析

一、 【导读】 

冷冻电子显微镜（cryo-EM）已经成为结构生物学领域不可或缺的工具。随着cryo-EM结构解析分辨率的不断提高，制备均匀薄冰成为实现高分辨率结构测定的关键步骤，尤其是对于分子量小于100 kDa的生物大分子，由于其信噪比较低，高分辨重构非常困难。为了降低背景噪音，高分辨率结构测定需要制备较薄冰层。然而，在cryo-EM样品制备中，冰层的厚度均匀性控制不佳，是高分辨率cryo-EM成像的主要挑战之一。

二、【成果掠影】

北京大学彭海琳、韦小丁，清华大学王宏伟及刘楠等联合发现样品支持膜的平整度对薄冰层的均匀性有影响，并提出了一种使用超平石墨烯（UFG）作为cryo-EM样品制备支撑膜的方法，以实现更好的玻璃态冰厚度的控制。他们使用UFG制备的均匀薄冰提高了冷冻样品的成像质量，成功地测定了三个分子量较小的生物样品，血红蛋白、α胎蛋白和链霉亲和素的三维结构，分辨率分别达到3.5 Å，2.6 Å和2.2 Å。相关成果以“Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM”发表在Nature Methods上。

 三、【核心创新点】

在本文中，作者提出了一种无褶皱的预拉伸超平整石墨烯（UFG）作为均匀薄冰制备的支撑膜。UFG的平整表面使得样品中的目标颗粒能够吸附到其表面上，处于同一平面，从而将它们与空气-水界面隔离开来，并且保证了薄冰的均匀性。

 四、【数据概览】

图1：石墨烯的粗糙度影响了冰厚度的均匀性。© 2022 The Authors

a.示意图显示，有皱褶不平整的石墨烯会导致波浪形的冰层。冰层厚度不一致，这可能导致颗粒分布产生10-20纳米的高度差异（ΔH）。在对倾转样品成像时，蛋白质颗粒信号被有皱褶的石墨烯所遮挡。b. 示意图显示，超平整石墨烯（UFG）会形成均匀的冰层，并使蛋白质颗粒吸附在UFG表面，分布在同一高度。

图2：超平整石墨烯膜的设计和批量制备。© 2022 The Authors

a、铜箔上生长的粗糙石墨烯膜的照片。 b、粗糙石墨烯的原子力显微镜（AFM）图像（上）和相应的示意图（下），显示铜箔表面的粗糙石墨烯具有密集的褶皱。 c、在铜箔和Cu（111）/蓝宝石晶片上生长的石墨烯膜的光滑度表征。 d、生长在Cu（111）/蓝宝石晶片上的超平整石墨烯的照片。 e、超平整石墨烯的原子力显微镜图像（上）和相应的示意图（下），显示石墨烯在晶片上的原子级平整表面。 f、将超平整石墨烯批量转移至电子显微镜载网的流程示意图（上）和实际照片（下）。 g、超平整悬浮石墨烯的典型原子力显微镜图像（下）和示意图（上）。红色曲线表示沿着孔中白色虚线标记的石墨烯的高度变化，ΔH是最大高度差异。 h、粗糙悬浮石墨烯的典型原子力显微镜图像（下）和示意图（上）。

图3：预拉伸的超平整石墨烯使冰层厚度更均匀。© 2022 The Authors

a, 纳米压痕实验的示意图。b、c，超平整石墨烯和粗糙石墨烯的力学强度(b)和预张力(c)的统计直方图。超平整石墨烯具有0.2N/m预张力。d、e, 超平整石墨烯(d)和没有预张力的粗糙石墨烯(e)在约10kPa的剪切应力下的起伏变化模拟。超平整石墨烯在剪切后仍然保持平整，而粗糙石墨烯的波纹幅度在相同的剪切应力下增加。f、g，左：示意图显示冷冻电镜样品制备时液体被滤纸吸走的过程。在此过程中，多余的溶液被吸去，留下超平整石墨烯(f)和粗糙石墨烯(g)上的薄液层。右：冷冻电镜图像显示超平整石墨烯(f)上的均匀玻璃态冰和粗糙石墨烯(g)上的波浪形玻璃态冰。

图4：超平整石墨烯和粗糙石墨烯制备的冷冻样品的电镜成像效果的表征。  © 2022 The Authors

a.冷冻电镜照片表明使用粗糙石墨烯支撑的冷冻样品在高倾角下出现明显皱纹，影响了颗粒的信号。b. 示意图和图表显示20S蛋白酶颗粒主要分布在石墨烯表面，高度分布变化约20纳米。c. 粗糙石墨烯支撑的冷冻样品的三个切面表明，颗粒分布存在高度变化，不均一。d. 用带有能量滤波器的电镜对粗糙石墨烯支撑的冷冻样品进行成像，显示冰厚度分布不均匀。e. 用超平整石墨烯支撑的冷冻样品在倾斜时成像没有明显的皱纹。f. 超平整石墨烯支撑的冷冻样品中的颗粒吸附在石墨烯表面，处于同一高度。g. 红色箭头指示的三个切面表明使用超平整石墨烯支撑的冷冻样品的高度变化较小。h. 用带有能量滤波器的电镜对超平整石墨烯支撑的冷冻样品进行成像，冰厚度分布均匀。i. 粗糙石墨烯支撑的冷冻样品和超平整石墨烯支撑的冷冻样品的颗粒欠焦值分布不同，说明粗糙石墨烯支撑的冷冻样品中颗粒的高度分布差异更大。j. 样品颗粒随着成像剂量积累而产生漂移现象，但颗粒在超平整石墨烯支撑的冷冻样品中移动更小。k. Guinier图表明，超平整石墨烯支撑的冷冻样品的图像质量更好。

图5：单颗粒冷冻电镜对三个分子量较小的生物样品进行高分辨率结构测定。© 2022 The Authors

a、d、g：超平整石墨烯支撑的血红蛋白(a)、α-胎蛋白(d)和链霉亲和素(g)的冷冻电镜图像。插图显示了颗粒的二维分类平均结果。比例尺为20 nm。b、e、h：最终重构分辨率为3.5 Å的血红蛋白密度图 (b)，2.6 Å分辨率的α-胎蛋白(e)，2.2 Å分辨率的链霉亲和素(h)。c、f、i：从血红蛋白密度(c)和α-胎蛋白密度(f)中选择出来的局部的密度与相应的原子模型搭建结果；从2.2 Å链霉亲和素密度中提取的代表性氨基酸残基的密度与相应的原子模型(i)。

五、【成果启示】

总言之，本文介绍了使用在Cu（111）/蓝宝石晶片上生长的超平整石墨烯，通过面对面转移方法批量化制备的电镜载网。与常用的铜箔生长的石墨烯支撑膜相比，超平整石墨烯具有优异的机械强度，能够更好地控制均匀薄冰，提高冷冻电镜图像质量。利用超平整石墨烯载网，作者解析出血红蛋白、α-胎蛋白和链霉亲和素的较高分辨率的冷冻电镜结构。另外，超平整石墨烯将可以实现更可控的生物活性功能化修饰，高亲和力和生物友好性地识别目标生物分子。这项工作为其他二维材料在结构生物学中的应用提供了启示。

原文详情：Zheng, L., Liu, N., Gao, X. et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nat Methods 20, 123–130 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01693-y