卡内基梅隆大学Nat Biotechnol：一种用于扩张显微术的通用分子锚定策略

一、【导读】

对生物系统的全面理解需要精确地了解从组织水平到单个生物分子长度尺度上组分的空间排列。而扩张显微术(ExM)是一种仅使用衍射极限荧光显微镜就能实现的纳米级成像的技术。ExM以物理和各向同性的方式放大细胞和组织:生物分子共价连接到致密和可溶胀的聚电解质水凝胶上，并在化学处理后在水中彼此远离。扩张显微镜通过物理和各向同性放大嵌入遇水膨胀的水凝胶中的保存的生物标本，使传统显微镜的纳米成像成为可能。目前的膨胀显微镜方案需要预先用反应性锚定化学物质进行处理，以将特定的标记和生物分子类别连接到凝胶上。简化这一步骤，将使得扩张显微镜的应用更加广泛。

二、【成果掠影】

卡内基梅隆大学Yongxin Zhao教授描述了一种名为Magnify的策略，该策略使用机械坚固的凝胶来保留核酸、蛋白质和脂质，而不需要单独的锚定步骤。Magnify可将生物标本放大11倍，并能够使常规光学显微镜上以约280 nm衍射极限的物镜和有效分辨率约为25 nm的条件下对细胞和组织进行成像，如果结合超分辨率光学波动成像，则有效分辨率约为15 nm。并且在广泛的生物标本上演示了Magnify，提供了对纳米级亚细胞结构的深入了解，比如来自小鼠大脑的突触蛋白，福尔马林固定石蜡包埋的人类肾脏中的足细胞足突，以及药物处理的人类肺类器官中的纤毛和基底体缺陷。相关成果以“Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy”发表在Nature biotechnology上。

三、【核心创新点】

采用一种名为Magnify的策略，Magnify使用水凝胶配方，保留了生物分子的光谱，从而消除了单独的分子特异性锚定步骤的需要。

四、【数据概览】

图1  Magnify协议的设计和验证。©2023 The author(s)

a，Magnify方案。b，Magnify凝胶化学。c, Magnify展开的小鼠脑切片。d，蛋白质水解消化后荧光信号被保留。e，在不同锚定和均质化策略下，FFPE人类肾脏切片(蓝色)和PFA固定小鼠大脑切片(绿色)中蛋白质保留的比较。f，在Magnify框架下，不同组织类型的蛋白质保留比较。g，Magnify后免疫染色。h, Magnify可以实现纳米级突触结构的可视化。i，用Magnify测量小鼠大脑中homer-bassoon突触对的距离。

图2 Magnify在几种组织类型中的验证。©2023 The author(s)

a,b，在×60成像并使用SOFI处理的人类肾脏扩张前图像示例(a)与在×40使用Magnify拍摄的相同FOV扩张后图像(b)进行比较。c -e, RMS长度测量误差作为DAPI (c)， ACTN4 (d)和Vimentin (e)展开前与展开后图像测量长度的函数。f,g，如a和b所示的人类前列腺图像示例。h,i, RMS长度测量误差作为DAPI (h)和ATPIF (i)展开前和展开后图像测量长度的函数。j-o，在几种人体组织类型中验证Magnify。p-r，人体组织的3D图像示例.

图3 用Magnify成像生物标本中的蛋白质、核酸和脂质。©2023 The author(s)

a，虚线柱状图显示热变性缓冲液中脂质保留率随均匀化时间的变化。b，脂质在完全展开的Magnify处理小鼠大脑的可视化。c，用亲脂性染料DiD在Magnify处理的小鼠大脑中显示线粒体。d, Magnify扩增HEK-293FT细胞高尔基膜的亲脂性染色。e, HEK-293FT细胞的Magnify图像与d相似，但显示DiD核膜标记。f, Magnify扩张小鼠脑血管的亲脂性染色。g，人干细胞来源的肺类器官中细胞外囊泡的电子显微照片。h，完全扩张的人肺类器官胞外囊泡的双色Magnify图像。j，放大g中被框住的区域。k, h内所选细胞外囊泡的三维重建，如蓝色虚线框所示。l, k中细胞外囊泡的正交图。m，人类淋巴结组织共聚焦图像的3D重建。n，扩展HEK-293FT细胞共聚焦图像的三维重建。

图4 使用Magnify显示内源性荧光团。©2023 The author(s)

a，用Magnify-ProK扩展的小鼠大脑矢状切片的最大强度投影。b，在a中放大显示成像场中的框内区域。c，放大b中被框住的区域。d, c合并图层的三维重建。e，在完全扩张的小鼠皮层中三维重建SST细胞，用Magnify进行扩张，用热表面活性剂溶液均质。f，放大e中框状区域，显示树突棘上的突触。g，与e相同样本的小鼠皮层完全扩张的SST神经元的单z平面。h，放大e中框状区域，显示突触位于SST树突上。

图5 Magnify-SOFI显示了细胞成分的超微结构。©2023 The author(s)

a, Magnify和Magnify - SOFI的比较。b，人干细胞来源的肺类器官纤毛的电镜图。c，与b相同类型组织的纤毛共聚焦图像。d, c纤毛三维重建。e，与b中相同类器官中线粒体的电子显微照片。f，与e中相同的膨大类器官的线粒体共聚焦图像。g, e中红框所示线粒体的正交图。h，成年小鼠脑室管膜细胞衬里室管膜纤毛和基底的Magnify -SOFI图像堆栈的最大强度投影。i, h的三维重建。j,k，将i中红色虚线框所示的单个室管膜纤毛3D图像放大。

图6 Magnify -SOFI显示了细微的纳米级药物诱导变化。©2023 The author(s)

a，正常人干细胞来源的肺类器官中纤毛的电子显微图。b，与a相似，只是肺类器官用紫杉醇治疗。c, Magnify -SOFI纤毛图像，与a相同类型的组织。d，与c相似，只是肺类器官用紫杉醇治疗。e，带有突出细根的基部的电子显微照片。f，与e同类型组织对应的基底体共焦图像。g，携带CCDC39突变的人支气管基底干细胞来源肺类器官的人干细胞来源肺类器官中纤毛的电子显微照片。h，与g相似组织中纤毛的Magnify -SOFI图像。i, Magnify -SOFI图像(上)和电子显微照片(下)有和没有缺陷纤毛的并排比较。j，在正常的、紫杉醇处理的(PAX样本)和CCDC39突变的人支气管基底干细胞来源的肺类器官(PCD样本)中正常和异常纤毛比例的堆叠柱状图。

五、【成果启示】

总之，由于Magnify是一种不依赖于复杂光学的化学策略，它提供了一个灵活的框架，可以适应一系列成像模式，凝胶化学和其他ExM策略。Magnify还可以通过其他模式实现纳米级成像，例如受激拉曼散射和各种基于质谱的成像技术。最后，Magnify可以在高含量成像系统中实现，其中可以生成大型数据集，以探索药物治疗和疾病相关变化对培养细胞和组织模型中生物分子纳米级配置的影响。

原文详情：Klimas, A., Gallagher, B.R., Wijesekara, P. et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol (2023).

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01546-1