哥大Nature Nanotech：可用于COVID-19快速检测的新型多重逆转录酶定量PCR技术

Eric_zhou 2年前 (2022-08-05) 2138浏览

【导读】

床旁检测（POC）也称现场检测，或近患者检测，它是一种可在短时间内将患者提供的样本进行检测的新兴技术，因其具有无需样品处理，检测时间短，样本需求量少，可在患者近旁进行实时监测的优点，而被广泛关注。经过数十年的发展，床旁检测技术已应用于手术室，重症监护室或急症室等场景，对患者的生化指标进行检测。

随着材料和技术的不断发展，研究人员希望能将床旁检测技术应用到聚合酶链式反应（PCR）技术中，以实现便携地，快速地核酸检测，特别是近两年COVID-19在世界范围内的流行，更需要一种快速的检测手段。然而，传统的PCR测试环境要求高，测试设备庞大，特别是热循环仪等，需要充足的时间进行升温和降温，因此，急需开发一种现场检测核酸并快速得到结果的技术。

【成果掠影】

近日，来自哥伦比亚大学的Samuel K. Sia教授和其团队成员在自然·纳米技术（Nature Nanotechnology）期刊上以“Multiplexed reverse-transcriptase quantitative polymerase chain reaction using plasmonic nanoparticles for point-of-care COVID-19 diagnosis”为题报道了一种可从人类唾液或鼻腔样本中快速检测SARS-CoV-2的RNA的小型光学器件。基于荧光探针的测试方法和等离子体纳米颗粒的增强作用，该器件可在单个反应容器中实现逆转录酶定量PCR（RT-qPCR），并具有等离子体热循环期间多重荧光监测的能力。

【核心创新点】

  1. 该工作首创性的将用于治疗的等离子体加热技术服务于PCR的加热环节，解决了传统PCR技术测试时间长，仪器大的难题。
  2. 该工作采用荧光检测识别特定核酸的方法，取消了从样本容器中去除金纳米颗粒的环节，缩短了测试时间，提高了检测技术的生物安全性。

【数据概览】

图1. 多重实时等离子体RT-PCR的测试原理和设计。a）多重实时等离子体RT-PCR的示意图，金纳米颗粒悬浮在0.2ml PCR管中的溶液中，其快速吸收LED的光并将其转化为热量，从而实现快速PCR热循环；b）仪器示意图；c）荧光检测系统示意图；d）系统内各组分非重叠光学光谱。@2022 Springer Nature Limited

图2. 快速、多重、等离子体RT-PCR测试结果。a）控制良好的温度序列，在15分钟内显示完整的RT-PCR；b）对a所示的数据进一步分析，整个45个周期内实现一致的加热和冷却速率，平均加热速率为6.7±0.2°C/s，平均冷却速率为 –4.7 ± 0.1 °C/s；c）等离子体RT-PCR系统的终点荧光测量的初始阳性扩增结果；d）使用纯化的RNA和快速扩增的初始光热扩增LoD数据（<16分钟）。@2022 Springer Nature Limited

图3. 集成实时荧光检测，无需去除AuNR。a）在RT-PCR反应中添加AuNR（OD为18）可淬灭原始荧光信号对比图；b）加入AuNR前后的Ct值对比；c）使用单个激发激光器和光谱仪实现多光谱检测，多元线性回归实现光谱反卷积；d）实时放大和检测；e）反卷积荧光值（针对三个单独的靶标/颜色）与周期数的对比，以计算Ct值；f）AuNR OD对加热速率的影响；g）AuNR OD对荧光监测的影响。@2022 Springer Nature Limited

图4. 使用多重等离子体RT-qPCR检测SARS-CoV-2的灭活病毒和临床标本。a）终点荧光光谱检测；b）等离子体RT-qPCR运行的实时扩增曲线；c）N1和RP的Ct值；d）N1，N2和RP靶标的额外浓度的Ct值；e）N1 Ct值与QuantStudio（QS）比较；f）临床唾液标本检测十个阳性和九个阴性标本，显示100%敏感性和100%特异性；g）接收器工作特性（ROC）曲线；h）仪器与QuantStudio的N1 Ct值的比较；i）对靶标N1的20个阳性和29个阴性样本进行临床鼻腔标本检测，显示100%的敏感性和100%的特异性；j）在i中测试的试样的ROC曲线；k）用等离子体测试的鼻腔临床标本与QuantStudio测试的N1 Ct值的比较；l）临床鼻腔标本检测20例阳性和29例阴性样本的靶N基因，敏感性为100%，特异性为100%；m）在l中测试的试样的ROC曲线；n）用等离子体与QuantStudio测试的鼻腔临床标本的N基因Ct值的比较；o）绘制临床标本连续稀释的N1 Ct值的标准曲线；p）在等离子体仪器上测试B.1.1.7变体的连续稀释样本；q）对于针对中东呼吸综合征（n = 23）和人类冠状病毒NL63（n = 27）进行测试。@2022 Springer Nature Limited

图5. 样本的测试流程。a）自定义样品盒的图像，其中包括滤芯的拆卸组件、反应模块、柱塞和护罩；b）使用定制样品盒测量10μl样品的预分析工作流程；c）用于无萃取样品制备和等离子体热循环的样品到结果过程，具有实时多光谱荧光监测；d）11 种不同滤芯的测量精度实现了 9.2 ± 1.4 μl 的平均点胶量。@2022 Springer Nature Limited

【成果展示】

该工作开发了一种等离子体RT-qPCR技术，在诊断COVID-19和其他传染病方面具有众多优点：1）该技术无需去除样本容器内的金纳米颗粒，确保了其用于床旁检测的生物安全性，2）该检测技术具有较强的特异性反应，可以在早期检测出低Ct（判断阈值）的强阳性样本，3）该技术还可用于多靶标病毒的靶向检测，其在SARS-CoV-2变种越来越多的条件下，具有重要意义。总而言之，该工作所做的努力极大的促进了床旁检测PCR技术的发展，并为当下COVID-19的快速检测带来了新的解决方案。

文献链接：

DOI：10.1038/s41565-022-01175-4

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