Nat. Rev. Chem.：带你了解低温储存技术的前世今生！

一、【导读】

温度对酶的活性有很大影响，大多数酶的适应活动温度为30~40℃。高温可使酶蛋白变性、酶钝化，低温可抑制酶的活性，但不使其钝化。在细胞储存领域，细胞和生物制剂的低温存储可以保证从常规样本存储到新兴的基于细胞的治疗的所有生物医学研究，并确保细胞库提供经过认证的、稳定的和一致的细胞产品，例如种子样本、卵母细胞、精子以及新冠疫苗的存储及运输。这一领域始于60年前甘油和二甲亚砜作为低温保护剂的发现和广泛应用，然而这些工具并不适用于所有细胞，而对于难度较大的组织样，低温储存技术应用难度更大。

二、【成果掠影】

2022年月18日，Nature Reviews Chemistry以题为“Chemical approaches to cryopreservation”在线刊发了英国华威大学Matthew I. Gibson教授关于化学低温储藏的综述。在这篇综述中，Gibson教授重点介绍并批判性地回顾了发现和应用冷冻保存的新化学工具的方法，并总结了蜂窝冷冻保存过程中的损伤途径以及如何解决。随后还讨论了以生物为灵感的低温储存方法。研究人员描述了基于小分子和大分子的策略，包括冰粘合剂、冰核、冰核抑制剂和新兴材料，然而其确切机制尚未得到了解。最后，研究人员还包括探讨该领域的未来发展，包括自下而上的分子建模的应用和基于程序库的发现方法以及材料科学工具等。

三、【核心创新点】

低温存储的化学发展是新兴的领域，其未来研究方向主要有：

1、开发新的化学工具来应对低温储存的挑战，并厘清细胞低温储存损伤机制、细胞类型和冷冻方法之间存在微妙的差异。

2、研究极端条件下微生物并应用，研究特定机制（生化和生物物理）用于推动该领域的发展。

四、【论文掠影】

图一、低温保存过程中细胞损伤的潜在机制

当细胞冷却以进行低温储存时，以及在重新加温期间，会出现一些挑战。在冷却过程中，细胞外冰晶的形成导致细胞膜渗透不平衡，导致细胞脱水。在没有细胞外冰晶的情况下，样品可能在平衡冰点以下过冷，导致致命的细胞内冰晶形成。快速冷却速度和添加高浓度低温保护剂（CPAs）可以实现玻璃化，即无定形无冰晶状态。然而，高浓度的CPAs可能对细胞有毒。在升温过程中，冰晶可能发生再结晶，冰晶生长并导致机械损伤和细胞溶解。玻璃化样品可能变得不稳定和脱玻璃，导致进一步的冰晶生长。最后，冷冻可以诱导细胞凋亡，导致解冻后细胞延迟死亡。注意，这些都是极端情况，不一定同时发生，可以通过添加低温保护剂来部分缓解。

图二、玻化冷冻剂

为了实现玻化，样品必须冷却以获得玻化、无定形状态，没有异质（外来颗粒）或均质（随机排列的水分子）冰晶成核。（a）具有不同浓度的冷冻保护剂的水样样品的相图；（b）已研究中和毒性的小分子结构：二甲基亚砜（DMSO）、尿素和甲酰胺；（c）大分子化合物，如聚乙烯醇-聚醋酸乙烯酯共聚物（PVA-co-PVAc）和羧基化ε-聚赖氨酸（COOH-εPLL），已用于限制升温过程中样品的脱玻化作用。

图三、冰晶重结晶抑制剂

（a）冰晶的重结晶是指由小冰晶生长为大冰晶，是Ostwald熟化的一种形式。

（b）冰重结晶抑制剂（IRI）是减缓冰晶生长的分子，常见的IRI分子及抑制能力对比。

图四、用于低温储存的大分子冷冻保护剂

用于低温储存保护的冷冻保护剂：（a）混合电荷聚合物；（b）聚合物CPAs；（c）海藻糖聚合物；（d）细菌胞外多糖FucoPol。

图五、冰晶成核的控制

低温储存样品通常在异质冰成核（由外来粒子的存在催化形成冰晶）发生之前过冷到溶液的熔点以下。作为一个放热过程，冰晶的形成导致热释放和过冷溶液升温到接近熔点。热力学稳定的细胞外冰晶驱动细胞脱水，减少致命的细胞内冰晶形成的机会。在高于零度的温度下，成核会导致少量的结晶热（红线），然后逐渐恢复到设定的冷却速度（虚线），并需要更多的时间脱水。这通常通过添加冰核器来实现。低温（过冷度越高，蓝线）下的成核导致结晶热越大，随后的冷却速率越高，脱水时间越短，导致细胞内结冰。

图六、低温储存的生化调节途径

（a）海藻糖、L-脯氨酸和甜菜碱等天然渗透性物质通过调节生化途径，在低温下保护生物和细胞方面显示出了希望。

（b）Rho相关卷曲激酶（ROCK）的活性与失巢凋亡的生化途径有关，ROCK抑制剂Y-27632对该途径的抑制对冷冻后的胚胎干细胞有益。

五、【前景展望】

冷冻储存是生物医学发现和转化科学的重要工具。基于DMSO和甘油的开创性贡献，新的、更先进的细胞/组织模型和疗法将需要同样先进的冷冻储存工具来保护，最大化恢复功能，并确保冷冻储存方法与冷链需求保持一致。在这篇综述中，Gibson教授介绍了如何开发新的化学工具来应对低温储存的挑战，还描述了这个多变量问题的复杂性，其中需要解决多种损伤机制，细胞类型和冷冻方法之间存在微妙的差异（慢速和快速）。研究极端条件下微生物并应用它们的溶液（冰结合蛋白）或从它们那里学习开发具有高级低温保护功能的分子或聚合物，已经引起了人们的极大兴趣。为了解决这些挑战，需要一个真正的跨学科方法，使用结构和进化生物学，合成和计算化学，材料发现和细胞生物学。还需要为感兴趣的问题找到合适的材料。例如，在输给患者之前不能去除的一种新的冷冻保护剂必须符合严格的管理和安全参数。相比之下，在上游或基础研究中使用的低温保护剂可以更容易地应用和使用。在这个不断发展的领域中，显然不能仅仅依靠偶然的发现。因此急需研究特定机制（生化和生物物理）用于推动该领域的发展。

文献链接：Chemical approaches to cryopreservation ( Nat. Rev. Chem., 2022, DOI: 10.1038/s41570-022-00407-4)

本文由赛恩斯供稿。