国家纳米科学中心最新Angew：多肽原位自组装策略用于癌症免疫治疗

nanoCJ 3年前 (2022-01-20) 4855浏览

【背景介绍】

综合信号通路控制的生物学活动经常通过蛋白质复合物构象的形成（如炎性小体的组装）被激活的。研究显示，这些蛋白质复合物的产生严重依赖于其他生化分子的识别和激活，而在生理环境中对蛋白质的组装状态进行复制和操控迄今为止依然极具挑战性。自从国家纳米科学中心的王浩课题组在2015年首次报道了生物活性分子的体内自组装行为后，关于生物活性物质在肿瘤位点的原位和响应性组装的研究开始得到广泛的关注。然而，尽管基于体内自组装建立了酶响应组装的概念，但自组装分子靶向控制依然鲜见报道。

【成果简介】

针对这一挑战，国家纳米科学中心的王浩等人报告了一种可编程多肽分子，其由靶向和自组装模块两部分组成，支持通过靶向受体蛋白而实现的特定、高效的组装策略。通过绑定细胞膜受体，多肽的构象能够随着自组装活化能的降低而趋于稳定，从而促进肽-蛋白复合物低聚化。 基于此，研究首次设计合成了GNNQQNY-RGD多肽(G7-RGD)，通过识别整合素αVβ3受体来验证上述自组装概念的可行性。由于αVβ3的存在，游离G7-RGD的临界组装浓度从525 μM减小到33 μM，而由此生成G7-RGD 簇可驱动整合素受体的低聚化。最后, 研究还设计了双特异性组装肽antiCD3-G7- RGD，可有效驱动CD3的低聚化以及伴随的T细胞活化，最终实现T细胞介导的癌症免疫治疗。本文第一作者为Man-Di Wang以及Gan-Tian Lv，研究成果以题为“In Situ Self-Assembly of Bispecific Peptide for Cancer Immunotherapy”发布在国际著名期刊Angew上。

【图文解读】

 示意图一、靶向-招募自组装策略示意图

图一、受体介导的G7-RGD特异性、原位高效自组装

（a）G7-RGD不同浓度下的ThT荧光强度；

（b）G7-RGD与αVβ3共孵育后的ThT荧光强度；

（c）G7-RGD在反应不同阶段的势能图；

（d）ThT荧光动力学曲线；

（e）G7-RGD组装的圆二色曲线；

（f）G7-RGD自组装的二级结构定量

表一、G7-RGD和αVβ3在反应不同阶段的解离常数和吉布斯自由能结合常数

图二、靶向-招募组装策略设计及其实验验证

（a）G7-RGD和GPMVs共孵育4小时后的共聚焦图像；

（b）G7-RGD和GPMVs混合后的动力学曲线；

（c）处理条件与（a）相同，共聚焦图像展现了多肽在细胞膜聚集的荧光强度；

（d）不同时间点的荧光强度统计；

（e）多肽自组装纳米纤维（绿色）的伪彩共聚焦图像；

（f）NBD-G7-RGD处理的MCF-7细胞的共聚焦图像

图三、通过靶向诱导招募的组装过程

（a）通过招募Cy-G7进行NBD-G7-RGD组装的示意图；

（b）Cy-G7（红色信号）和NBD-G7-RGD（绿色信号）在MCF-7细胞上的共定位；

（c）（b）中白线的归一化荧光强度

图四、G7-RGD自组装调节受体整合素αVβ3的低聚化

 

（a）G7-RGD荧光信号的共聚焦图像；

（b）添加多肽后阳性细胞的NBD荧光流式分析；

（c）NBD表达细胞之间的比较；

（d）表达整合素β3-EGFP的MCF-7细胞的共聚焦图像

图五、G7-antiCD3自组装调节受体CD3的低聚化

 

（a）CD3+ T细胞和CD3- MCF-7 细胞上的G7-antiCD3荧光信号；

（b）流式分析显示随着多肽的加入，CD3+ T细胞上的NBD荧光信号也得到了加强；

（c）CD3+ T细胞和CD3- MCF-7 细胞中NBD+细胞的占比；

（d）由CD3-EGFP转导的MCF-7细胞的共聚焦图像

图六、AntiCD3-G7-RGD作为双特异性偶联物激活小鼠T细胞

（a）双特异性多肽序列诱导T细胞活化；

（b）流式分析测量加入antiCD3-G7-RGD后的NBD荧光信号；

（c）antiCD3-G7-RGD在T细胞膜上聚集形成纳米纤维的SEM图像；

（d）利用antiCD3-G7-RGD刺激后的ELISA测量；

（e）流式分析表达在T细胞表面的CD69；

（f）流式分析表达在T细胞表面的CD44

图七、靶向招募组装设计实现T细胞介导的细胞溶解

（a）伪色SEM图像观测到活化T细胞（绿色）进攻B16F10黑色素瘤细胞（紫色）；

（b）基于乳酸脱氢酶测量B16F10肿瘤细胞的细胞毒性

上述图片版权方 © Wiley-VCH GmbH, Weinheim

【小结】

综上所述，该工作开发了一种精巧高效的原位自组装策略。作者认为增强组装的主要机制源于将多肽固定在目标蛋白上以获得稳定结构从而降低了组装活化能。同时研究人员也不排除存在其他机制的可能性，例如有多肽配体结合引起的局部高浓度等。与原序列G7相比，TRA肽G7- RGD的特殊之处在于蛋白质特异性组装触发和超低的临界组装浓度。此外，整合素αVβ3受体在MCF-7细胞因自组装而低聚化的行为，可为调节生物功能开辟新的道路，同时靶向-招募组装策略也在T细胞膜上的CD3蛋白质中得到了验证，在这一实验中，除了改善组装情况外，簇态聚集的CD3还能够提升T细胞的活化。基于上述结果，antiCD3-G7-RGD这一双特异性偶联物不仅能够促进CD3受体的低聚化，还能发挥T细胞介导的肿瘤细胞溶解作用。 因此，靶向-招募组装代表了一种极具前景的方法，可扩展已有的自组装肽工具箱和开发在生物学上操纵受体低聚化的策略 。 

文献链接：In Situ Self-Assembly of Bispecific Peptide for Cancer Immunotherapy, Angew, 2021, DOI: 10.1002/anie.202113649.

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