“看见”化学反应——原子级分辨率透射电子显微镜是哪路神仙？

引言

分子是一种量子力学范畴内的实体，因此“亲眼见证分子的运动和反应”就成了化学家们孜孜以求的目标和梦想。而现在有了原子级分辨率透射电子显微镜，这个梦想终于实现。原子级分辨率透射电子显微镜又叫单分子原子分辨率实时TEM成像（SMART-TEM），早在2007年日本东京大学的Eiichi Nakamura就利用这一技术报道了单个碳氢化合物分子的构象变化，从此SMART-TEM开始进入了快车道发展阶段。

制造“渔具”捕捉分子

为了实现“看见”分子运动或者反应的目标，我们首先要在溶液中捕捉到目标分子，并将其带到纳米尺度的TEM视野中。针对这一问题，研究人员创造了各种“渔具”，用以在溶液中“钓”到感兴趣的“渔获”（分子）。其中，碳纳米管（CNT）及其锥形变体碳纳米角（CNH）凭借刚性和TEM接近的透明度而成为“钓鱼竿”的最佳选择。

图1 缠绕碳氢化合物链的连续时间TEM图像^[1]

• 范德华“鳗笼”

在最初的研究中，Eiichi Nakamura等人受到碳纳米管装载富勒烯的启发，提出了将碳纳米管作为“鳗笼”用以困住碳氢分子的策略^[1]。由此，研究人员可在TEM中获得连续时间内的缠绕型碳氢分子的运动行为（图1）。然而，这一方法只适用于具有疏溶剂性质的小分子，同时该小分子还要对碳纳米管展现出亲和性。

• 共价“鱼钩”

与碳纳米管凭借范德华力进行“捕获”不同，具有氨基的CNH可以作为化学“鱼钩”进行分子捕捉。利用标准的酰胺成键反应，研究人员可将分子固定到CNH上，从而在TEM中进行成像。

• 非共价“鱼钩”

最后，有研究还提出了一种“离子吊钩”，即CNH 羧酸盐阴离子在甲醇中可困住三价钆等金属阳离子，并将这些金属离子带到TEM铜网上进行成像。与此类似，通过阴/阳离子的结合可以设计多种多样的“鱼钩”，甚至可将此种策略拓展到氢键等弱相互作用力范围，形成超分子“吊钩”。

SMART-TEM的独特之处

经典的结构分析可以在气、液、固相以及平整的基质表面实现。而在SMART-TEM成像中，成像分子被连接到振动缓慢的碳纳米管上，因此可将分子/碳纳米管系统视为耦合的振荡器。在该系统中，碳纳米管热振动的低频部分通过碳氢单键或者范德瓦尔斯接触传递到成像分子上。尽管如此，在实际观测中研究人员发现，各向异性分子/原子运动在很大的温度范围（4-793K）内几乎不会受到碳纳米管温度的影响。

研究范例

1. [60]富勒烯的二聚化^[2]

高分辨TEM已经证明了其是一种可对小分子及其运动进行时间分辨成像的强大工具。而下一个挑战就是如何通过监控反应分子原子级区位的时间相关变化来对化学反应进行可视化。一旦这一策略和目标得到实现，就能够获得其他方法所无法获得的重要信息。

富勒烯分子逐渐键合的高分辨图像

针对这一挑战，日本产业技术综合研究所（AIST）的Masanori Koshino等人成功探索了一个化学反应可视化的案例，即在碳纳米管内观察到了富勒烯的二聚化过程。在碳纳米管这一有限的纳米尺度环境中，反应分子只能在一个维度进行平移运动，其自由度会显著减少。因此，研究人员得以在碳纳米管中观察分析富勒烯和金属富勒烯的双分子反应。研究显示，富勒烯二聚化在初步阶段是可逆的，这是因为在两个富勒烯分子间产生了非键合的自由旋转；而在第二阶段，电镜视野中出现了融合结构的衬度，这说明两个富勒烯分子进一步融合形成花生型结构；进一步的电子束辐照会促进形成具有缺陷的管状结构，而最终产物会呈现出拉伸型花生结构。不仅如此，研究还发现高剂量的低能电子能够提升初步阶段而非第二阶段，这表明第二阶段所需的是高能电子。

 2. 过渡金属簇与碳纳米管的反应^[3]

高分辨TEM成像锇簇与碳纳米管之间相互作用的不同阶段

钨等过渡元素被装载进单臂碳纳米管后能呈现出截然不同的亲和性和反应活性，这一现象在较早的研究中被德国乌尔姆大学的Ute Kaiser以及英国诺丁汉大学的Andrei N. Khlobystov、Elena Bichoutskaia等人成功揭示。利用低压像差校正高分辨TEM，并在80keV电子束的激发下，研究人员发现钨与碳纳米管的反应非常弱，而铼则能在边臂上创造局部缺陷。相比之下，锇则能轻易地形成扩大化的缺陷，从而压缩碳纳米管的边壁造成管状结构的决裂。这一高分辨TEM还能在原子水平对由金属-碳键合造成的结构转变进行成像，可揭示这类键在调控过渡金属簇和碳纳米管之间相互作用中所扮演的角色。对反应活性进行排序可知，锇大于铼、铼大于钨，并且反应活性与金属簇的尺寸、形状或者取向均没有关系，却只与金属-纳米管键合能以及金属-碳纳米管之间转移的电子密度数相关。因此，通过选择合适的电子束能量，金属-纳米管相互作用可以被控制（激活或者抑制），其中当电子能量低至20 keV时，研究人员就无法观察到碳纳米管内邻近金属簇附近的转变行为。

3. 成像单分子的异质成核^[4]

在分子尺度对异质成核进行观察研究对人们来说一直以来都是巨大的挑战。由于在分子尺度探索反应活动的难度，人们还无法对有机分子晶体在表面的成核行为进行理解和解释。

结晶前驱体及其在CNH上结晶的SMART-TEM图像

有鉴于此，日本东京大学的Eiichi Nakamura团队展示了CNH表面的单分子模板可以通过介导无序移动分子纳米簇的形成来实现两个有机分子的成核结晶。为了实现这一目的，关键在于衬底的选择。研究人员选择含有氨基的海胆状CNH聚集颗粒作为衬底，其丰富的氨基可以轻易实现酰胺成键。在SMART-TEM的帮助下，研究人员发现分子纳米簇最多由15个分子组成，并且在在溶液中的数量也比晶体要少。同时，如果缺少单分子模板的物理吸附，晶体也不会出现。这一研究发现表明模板诱导异质成核机理由两步均质成核步骤组成。

4. 分子链的构象分析^[5]

在复杂成分的分子集合体中，构象状态的变化取决于它们之间的反应能垒。因此，有机化学家在进行实验时，总会在分子模型中进行构象分析，以考量局部构象和全局形状对分子的影响。然而，长期以来还没有任何实验方法能够直接支持这一构象分析，从而为我们提供单分子中化学键的构象选择。

在SMART-TEM中观察到扭曲构象的分子

东京大学的Koji Harano、Eiichi Nakamura和日本产业技术综合研究所（AIST）的Masanori Koshino等人描述了一项关于测定单个全氟烃基富勒烯中每个碳碳单键的构象。这些全氟烃基富勒烯分子要么被装载进单壁碳纳米管中，要么被吸附在CNH的外表面进行研究。在分析了碳纳米管中82个单分子（在120 kV电子束下）后，研究发现大约6%的CF₂–CF₂键和大约20%的CH₂–CH₂键为扭曲构象，这一定量分析与基于集合体的构象数据是一致的。而TEM图像也表明分子更倾向于以单一取向进入碳纳米管。而相比于在碳纳米管中，附着在CNH上的分子移动更加自由，同时展现出了更加丰富的构象，这也表明TEM是一种测定柔性分子动态形状的多样化策略。

 5. 复杂分子的结构变化^[6]

对于结构较为简单分子的TEM成像可以简便分析其构象变化，同样地，SMART-TEM对于复杂分子的结构分析同样非常有用。同时，碳纳米管的限域效应不仅限制了装载分子的尺寸，也限制了分子进行构象变化的可能，这些问题对于复杂分子来说显得尤为突出。

一系列三酰胺-NH共轭物弯曲构象的TEM图像

东京大学的Eiichi Nakamura等人利用氨基化的碳纳米管取代传统碳纳米管，通过酰胺键键连生物素化的二酰胺分子，并对其进行高分辨的TEM成像测定。实验获得的静态图像和动态影像不仅能够帮助研究人员研究分子构象，也可以呈现其随时间变化的动态过程。进一步通过建模和模拟，研究人员还能够从10的8次方可能性中分辨合理的构象。除此之外，这些图像也为“碳纳米管的弯曲区域具有化学活性”这一现象提供了直接的证据。

6. 观察分子构象变化的选择性激发行为^[7]

尽管σ键旋转及随后的构象变化是化学的基本研究领域，但对这一现象进行原子级成像长期以来都是科学家无法实现的目标。虽然，SMART-TEM的出现可以原位测定单个有机分子的构象变化，但在缺乏改变和定量分子运动量级和频率的情况下，TEM成像还无法成为有效的研究工具。

生物素化分子及其在不同加速电压下运动的示意图

有鉴于此，东京大学的Eiichi Nakamura和Koji Harano等人发表文章报道了分子运动的频率可以通过调整电子加速电压来进行调控。在SMART-TEM中，通过降低电子加速电压（从120到80再到60 kV）可以增大散射截面，从而提高分子运动频率，再对TEM影像中的相邻帧之间进行交叉关联（cross-correlation）分析可以进一步定量这些分子运动。研究以附着在CNH上的生物素衍生物为例，发现相对较硬的分子在加速电压为80和120 kV时显得更为静态，而在60 kV时振动比较频繁；而柔性程度更高的分子在80 kV时就可以进行可观的运动，从而通过真空中σ键的序列性旋转来可视化地展现逐步能量驰豫过程。而在SMART-TEM技术发展之前，这类能量驰豫信息只能通过理论模拟的方法获得；因此高分辨TEM的发展为实验获得分子信息提供了强大的工具。

展望

SMART-TEM技术发展至今，在单分子成像方面展现独特的优势。在这项技术中，加速的电子速度可以变得非常快，使得经过分子的时候都可以带着埃秒级的分子信息，即使如此，电子核键旋转的概率行为也使得TEM图像解释成为了一个相对复杂的问题。

在未来，利用TEM进行化学转变的动力学研究是进入分子科学的量子力学世界的通道。而进一步的扩展应用还包括单个蛋白质及其运动的成像。此外，处理分子混合物成像也是这一TEM技术的独特优势，有望在不对原始材料进行提纯净化的条件下实现成分的结构分析。总而言之，分子及其集合体的原子分辨率级成像是一种研究纳米尺度实体的简单且强大的工具，能够为研究人员连接量子力学和现实世界。

参考文献

[1] Imaging of Single Organic Molecules in Motion. Science, 2007, 316, 853.

[2] Electron Microscopic Imaging of a Single Group 8 Metal Atom Catalyzing C−C Bond Reorganization of Fullerenes. Nat. Chem., 2010, 2, 117.

[3] Interactions and Reactions of Transition Metal Clusters with the Interior of Single-Walled Carbon Nanotubes Imaged at the Atomic Scale. JACS, 2012, 134, 6, 3073.

[4] Heterogeneous nucleation of organic crystals mediated by single-molecule templates. Nat. Mater., 2012, 11, 877.

[5] Conformational Analysis of Single Perfluoroalkyl Chains by Single-Molecule Real-Time Transmission Electron Microscopic Imaging. JACS, 2014, 136, 1, 466.

[6] Imaging of Conformational Changes of Biotinylated Triamide Molecules Covalently Bonded to a Carbon Nanotube Surface. JACS, 2008, 130, 25, 7808.

[7] Electron Microscopic Observation of Selective Excitation of Conformational Change of a Single Organic Molecule. JACS, 2015, 137, 10, 3474.

本文由NanoCJ供稿。

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