武汉大学张先正Adv. Funct. Mater.: 细菌诱导的肿瘤特异性凝血吸引抗体工程血小板用于检查点抑制剂免疫治疗

【引言】

通常，无序的肿瘤微环境伴随着缺氧，过营养化和免疫赦免，这可以为细菌，尤其是兼性厌氧菌提供生存空间。因此，细菌非常适合用于准确区分肿瘤组织和正常组织。基于此，各种细菌被创造性地用作抗肿瘤平台，已被基因改造为蛋白质药物工厂，或被重塑为用于难治性肿瘤治疗的免疫疗法疫苗。更重要的是，我们发现低致病性大肠杆菌TOP10除具有靶向肿瘤的能力外，还可以在肿瘤区域而非正常组织中引起快速而强烈的血液凝结。在静脉注射该细菌后，可观察到在肿瘤内尤其是未成熟的脉管系统中发生明显的出血。我们推测这种细菌诱导的凝结（BIC）是由细菌引起的局部炎症触发，并进一步造成纤维蛋白沉积和血管破坏。同时，这一肿瘤中由炎症介导的异常出血和血液凝固可触发免疫细胞的显着募集和浸润，包括T细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞等在内的天然免疫细胞是抵抗肿瘤细胞生长的杀手。然而，肿瘤细胞中广泛存在的免疫检查点包括程序性死亡配体1（PD-L1），细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和CD47等在很大程度上阻碍了免疫细胞对其识别作用，降低了其对肿瘤细胞的杀伤作用。引入免疫检查点抑制剂可以很好地缓解肿瘤中免疫细胞的免疫抑制。但是传统的免疫检查点抑制剂不是肿瘤特异性的，并且可能在正常组织中诱导全身性免疫激活。而细菌能够精准地在肿瘤中引起血液凝结，突出了肿瘤的特征，并因此而吸引大量的血小板进入肿瘤微环境。基于此，血小板非常适合被抗体工程化，作为在人工诱导的BIC后递送免疫检查点抑制剂的天然载体生物材料。

【成果简介】

由于细菌对肿瘤微环境的特异性靶向能力，细菌可以作为有希望的抗肿瘤平台。武汉大学张先正教授（通讯作者）发现静脉内施用大肠杆菌TOP10可在肿瘤组织而不是正常组织中引起快速而强烈的血液凝结。已证明大肠杆菌TOP10可以充当凝血级联的激活剂，以触发肿瘤内特异性的血液凝固和炎症，并在肿瘤中募集大量巨噬细胞。另外，募集的巨噬细胞被证实能够被细菌壁中的脂多糖由促肿瘤的M2表型极化成具有抗肿瘤功能的M1表型。基于上述发现，进一步制备了由CD47抗体修饰的凝血趋向性血小板，其具有细菌治疗的肿瘤的趋向性从而运送CD47抗体精准到达肿瘤区域。实验结果证明，通过工程化血小板CD47抗体的准确递送，阻止了肿瘤细胞发出的“不要吃我”信号，从而促进了肿瘤细胞极化M1型表型巨噬细胞的吞噬作用。肿瘤中这种由细菌引发的局部凝血与工程化血小板联用，可能为准确递送免疫检查点抑制剂和促进肿瘤免疫治疗找到更多可能的发展方向。该成果以题为“Antibody Engineered Platelets Attracted by Bacteria-Induced Tumor-Specific Blood Coagulation for Checkpoint Inhibitor Immunotherapy”发表在Adv. Funct. Mater.上。

【图文导读】

Scheme 1.本研究中的治疗过程示意图

Figure 1.大肠杆菌TOP10能够特异性引发肿瘤区域的局部凝血

a）大肠杆菌TOP10在肿瘤区域引发特异性凝血示意图 b）细菌、灭活细菌和阴性对照组处理后的肿瘤组织的H＆E染色，革兰氏染色和Masson染色切片 c）肿瘤区域血管的光声成像 d）细菌和灭活细菌处理后的CT26肿瘤中厌氧血红蛋白和好氧血红蛋白的代表性二维光声成像 e）细菌和灭活细菌处理后的CT26肿瘤中的氧合血红蛋白饱和度定量 f）细菌、灭活细菌和阴性对照组中CT26肿瘤的凝血因子VII浓度 g）KEGG富集分析鉴定出的参与血液凝固和炎症功能的差异代谢途径 h）与血液凝固和炎症功能有关的不同代谢物的热图 i）在不同时间点细菌处理后的CT26肿瘤中TNF-α的浓度 j）在不同时间点细菌处理后的CT26肿瘤中IFN-γ的浓度 k）在不同时间点细菌处理后的CT26肿瘤中IL-1β的浓度 l）在不同时间点细菌处理后的CT26肿瘤中IL-6的浓度 m）在不同时间点细菌处理后的CT26肿瘤中IL-12P40的浓度

Figure 2.大肠杆菌TOP10在肿瘤内实现巨噬细胞的募集和极化

a）细菌治疗组和阴性对照组中嗜中性粒细胞，DC细胞和巨噬细胞的代表性流式细胞仪分析和相对定量 b）细菌、灭活细菌和对照组的CT26肿瘤的免疫组织化学染色 c）用细菌、灭活细菌和生理盐水分别处理的CT26肿瘤中M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的代表性流式细胞术分析 d）不同处理对巨噬细胞极化的代表性流式细胞术分析

Figure 3. CD47抗体修饰的工程化血小板的制备

a）通过荧光原位杂交技术标记的大肠杆菌TOP10在肝，肾和CT26肿瘤中的荧光分布。b）细菌处理组和阴性对照组小鼠的肝，肾和CT26肿瘤的革兰氏染色 c）在不同时间点注射DIR标记的细菌后对携带CT26肿瘤的小鼠的体内荧光成像 d）注射DIR标记的细菌 48 h后主要器官和肿瘤的离体荧光成像 e）注射细菌 48小时后，不同器官中细菌菌落的平板涂布计数 f）细菌在肿瘤中引起凝血的可能机制 g）P@aCD47的合成方法和示意图 h）未活化（+前列腺素E1）和活化（-前列腺素E1）血小板的生物扫描电子显微镜图像 i）装载有CD47抗体的血小板表面共聚焦显微镜图像 j）血小板表面抗体装载情况的流式细胞仪分析 k）在注射细菌后不同时间间隔，继续注射Cy5.5标记的工程化血小板，在CT26荷瘤小鼠中对血小板进行体内荧光成像，评估其靶向凝血部位情况。

Figure 4.在异种移植CT26荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用

a）治疗CT26异种移植荷瘤小鼠的简要时间表 b）不同治疗后的肿瘤体积 c）不同治疗后每只小鼠的个体肿瘤生长动力学 d）不同治疗后所收获肿瘤的代表性照片 e）不同处理后的小鼠肿瘤的体内生物发光成像 f）不同处理后小鼠的血生化与血常规检查指标 g）不同处理后的小鼠血浆CRP浓度 h）不同处理后的小鼠的血浆PCT的浓度 i）不同治疗肿瘤中IFN-γ的浓度 j）不同治疗肿瘤中IL-6的浓度 k）不同治疗肿瘤中IL-12P40的浓度 l）代表性的流式细胞术分析和不同治疗方法的M1巨噬细胞和M2巨噬细胞的定量结果 m）不同治疗后肿瘤组织的免疫荧光染色（CD206）

Figure 5.在表达荧光素酶的原位CT26肿瘤小鼠中的抗肿瘤作用

a）携带小鼠的原位CT26肿瘤的体内荧光成像（0-24小时）和生物发光成像（36小时） b）DIR标记的细菌的体内荧光成像（0-24小时）和原位CT26荷瘤小鼠不同器官的生物发光成像（36小时） c）经过不同治疗的小鼠原位CT26肿瘤的体内生物发光成像 d）不同治疗方式的结肠内原位CT26肿瘤的H＆E染色图像和照片 e）肿瘤组织的免疫荧光染色

【小结】

作者在本文中证实了在静脉注射大肠杆菌TOP10之后，在肿瘤区域中可以特异性观察到明显的凝血现象，并且分别在组织水平，细胞水平和代谢水平验证了这种细菌诱导凝血的发生。更重要的是，作为重要的吞噬细胞类型之一，已确认大量的巨噬细胞可通过细菌触发的炎症募集到肿瘤组织中，并通过细菌壁中的脂多糖（LPS）将其进一步极化为具有抗肿瘤功能的M1表型。但是，肿瘤细胞中CD47的上调可以提供抗吞噬的“不要吃我”信号，从而避免了巨噬细胞的识别。为了阻止CD47和M1类表型巨噬细胞中的信号调节蛋白-α（SIRP-α）之间的相互作用，受血小板趋向于凝血部位的特性，利用细菌特异性引发肿瘤组织内的凝血，从而利用工程化血小板将CD47抗体作为免疫检查点抑制剂精准递送到肿瘤细胞表面。通过点击反应，将CD47抗体修饰到纯化的血小板表面，以获得用于激活巨噬细胞吞噬作用的人工免疫检查点抑制剂载体P@aCD47。文章证明这种细菌诱导的血液凝结极大地突出了肿瘤的特征，并为人工免疫检查点抑制剂载体准确地提供了特定的肿瘤定位。这种联合策略可以极大地启发肿瘤免疫疗法的靶向治疗。

文献链接：Antibody Engineered Platelets Attracted by Bacteria-Induced Tumor-Specific Blood Coagulation for Checkpoint Inhibitor Immunotherapy, Adv. Funct. Mater., 2021, DOI:10.1002/adfm.202009744

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