跟着顶刊学测试｜原子力显微镜：探寻力与蛋白质等电点的纠葛

等电点（pI）是表面和分子的一种固有性质，被定义为实体携带零净电荷的pH值。pI对蛋白质特别重要，因为它与分离科学、医药应用、传感和非特异性吸附(污垢)有关，而pI的值受氨基酸组成、化学侧链修饰和三维构象的影响。目前采用的测量方法需要高浓度的已知蛋白质溶液，这就大大限制了蛋白质pI的测量。因此本文的作者在Nature Technology杂志上就介绍了一种基于微量蛋白质结合原子力显微镜(AFM)力谱学检测蛋白质pI的方法。该方法中，最重要的一个测量工具就是蛋白质共价连接到功能化原子力显微镜(AFM)胶体探针，可用于测量已知表面电荷的蛋白质与相对PH值的AFM力谱之间的相互作用，进而直接提供未知蛋白质在一个广泛的pH值范围(4-11) 的pI值。 AFM是一种敏感和通用的技术，可用于评估固定在尖端和固体基质表面的相互作用大分子(例如蛋白质)之间的力-距离关系。蛋白质和固体基质表面之间的黏附力可以通过缩回在固体表面的蛋白质固定AFM探针来量化，与此同时，自组装单分子膜与底物之间的黏附力随溶液pH值和离子强度发生相应的变化，因此就可以利用AFM测量蛋白质在不同PH值中的黏附力来确定蛋白质的pI。

首先，制备蛋白质固化的功能化AFM探针和不同PH值显示不同表面电荷的固体基质；然后将在明确PH下测得的黏附力大小与PH值之间的转化特征定义为蛋白质的pI。其中最重要的固体基底是利用各方面条件都非常稳定的静电聚合电解质由层对层（LbL）沉积方法制备而成，采用的静电聚合电解质主要有聚(异丁烯-马来酸酐)(P1)和工业的聚乙烯亚胺 (PEI)（图1a）。固体基底表面的电位则是通过调节基底沉积过程中使用的浸渍液的PH值来实现。因此，本文主要制备了PH值在4以上的带负电的LbL₄基底和PH值在11以下的带正电的LbL₁₁基底来保证一个比较稳定的测试条件（图1b）。

其次，利用原子力显微镜AFM测量蛋白质共价连接的功能化探针与设计表面之间的拉力作为PH值的函数来估算蛋白质的pI值（图1c）。选用四个已知pI值的牛血清白蛋白(BSA)，肌红蛋白，牛血浆纤维蛋白原(纤维蛋白原)和核糖核酸酶A(RNase A)经蛋白结合剂戊二醛与探针稳定共价附着，随后反复测量不同表面区域的固体基底来探测更大的截面。以肌红蛋白为例，随着PH值的变化，蛋白质修饰探针与固体基底表面之间的力距离曲线图中可以看到，调节AFM实验中电解质的pH值时，LbL₄和LbL₁₁的黏附力有显著差异。在pH值为7-8时，LbL₄记录到了低黏附力曲线，这意味着肌红蛋白对表面的亲和力较低，而当pH值降低到6.5或更低时，黏附力显著增加(图1d)。

随后观察到的典型锯齿状拉力曲线表明，在探针分离过程中蛋白质和表面之间存在多种相互作用。然而，当单个样品在经过大约100个方法测试之后，其数据显示测得的力值有良好的再现性与较低的标准偏差(图2)。这表明不可逆的蛋白质表面相互作用在讨论的实验中并没有发挥关键的作用。图2a中的黏附力数据(肌红蛋白)清晰地表明，在低pH值时，带负电荷的表面和带正电荷的肌红蛋白之间存在静电吸引。在pH值为7.0-8.0范围内观察到相对较低的粘附力(0.25±0.07 nN)，这可归因于蛋白质和表面之间的其他非库仑相互作用。通过观察相互作用力的阈值，我们可以得出肌红蛋白的pI值在6.5-7.0范围内的结论。

在LbL₁₁模型带正电荷表面的实验中，则观察到相反的黏附现象(图1d)。当pH值为8.0时，蛋白质黏附力(0.70±0.08 nN)最强，随着pH值的降低，黏附力逐渐降低(图1d(右))。除此之外，在pH值6.5-7.0范围内再次检测到黏附力的阶梯变化。当pH值低于6.5时，黏附力仍然很低，这表明蛋白质和带正电荷的表面之间的相互作用是非库仑性的。因此本实验证实了，当pH值在6.5-7.0范围内时，蛋白质的净电荷由负变为正，越过pI点(图2a)。

接下来，继续用BSA、纤维蛋白原和RNase A蛋白装饰的探针也进行了类似的实验(图2b-d)。通过分析不同PH值下不同蛋白质与带负电(LbL₄)和带正电的(LbL₁₁)表面黏附力曲线的直方图，可以得出BSA，纤维蛋白原，肌红蛋白和RNase A的pI值与表1中的文献已知蛋白质pI值相符合。模型蛋白从低pI (BSA)到高pI (RNase A)，随着pH值的改变，黏附力发生突变。过渡阶段发生在一个狭窄的pH范围内，通常不超过0.5 个pH单位。黏附力的强度与实验的pH值的对照图(图2)表明，当蛋白质和表面携带相反的电荷时，静电力主导相互作用。当越过pI值并获得相同的蛋白质和底物电荷符号时，在所有实验中均可观察到低黏附力水平下的非库仑相互作用。以上结果表明，基于AFM的方法是检测蛋白pI值的可靠方法。根据AFM的敏感性，我们可以推测，进一步细化和调整pH尺度后，可以更准确地估计蛋白的pI范围。

此外，作者以pH =4.2时BSA修饰探针与LbL₄之间的粘附力为例(图2b)，以估算有助于黏附力分离的BSA蛋白的数量。检测到的BSA粘着力值为1 nN(图2b)，因此估计界面张力值为0.4 mJ m^-2。根据Hertz模型, 在pH=4.2时LbL₄表面的复合弹性常数K估计为5 mpa。因此，将零电荷时的接触半径a₀估计为72 nm，将拉回时的接触半径a_s估计为45.5 nm。据报道BSA的蛋白半径为2.1 nm，这相当于在探针拉回事件中大约有470个蛋白质相互作用。这个估算证明了该方法的威力，因为作者只使用几百个蛋白质分子就可以完成在pI值的预估。

最后，一步一步的验证下来之后，接下来就是利用以上验证过的功能化AFM设备来检测一个未知pI值的蛋白质物种来进行实践检验真理了。作者选用了一个与粘附力相关性非常高的藤壶幼虫蛋白来进行试验。为了探究藤壶幼虫蛋白的pI，作者先按照之前的方法先将蛋白固定在戊二醛功能化的AFM探针上，随后使用这种改良的探针，在LbL₄和LbL₁₁的表面，测量不同pH值溶液中幼虫蛋白与表面之间的黏附力。在带负电荷的LbL₄表面， pH=10.5时测得的黏附力较低，在9.7-10.5的pH范围内黏附力无显著差异(图3b)。然而，当pH值从9.7降低到9.6时，黏附力显著增加，并且随着pH值的降低，黏附力进一步增加。在pH值为8.5时观察到最强的黏附力，其值为1.7±0.3 nN(图3b)。在带正电荷的表面(LbL₁₁)上进行的实验表明，在8.5-9.6的pH值范围内，测得的黏附力较低且在此范围内，黏附力无显著变化差异(图3d)。当pH值从9.6增加到9.7时，黏附力没有显著提高，在pH=10.5时黏附力最高，为1.27±0.18 nN。从这些数据可以推断，藤壶幼虫蛋白在pH值为8.5-9.6范围内带正电荷，所表现的低黏附力主要归因于非库仑相互作用。相比之下，这些蛋白在pH值为9.7-10.5范围内携带总电荷为负电荷。根据以上观察，作者得出的结论是，藤壶幼虫蛋白的pI位于9.6-9.7范围内。由于海水的pH值通常在7.8-8.3之间，由以上结果表明藤壶幼虫蛋白在海水中携带净正电荷。作者进一步推测，由于海洋的自然表面覆盖着带负电荷的生物膜和悬浮物，因此藤壶幼虫蛋白较高的pI值与其黏附功能相一致。综上所述，作者探索得出的新型功能化AFM实验检测蛋白质的pI值优点非常明显，即蛋白质的用量非常小，仅用470个蛋白质分子固定在探针上就可以与表面相互作用从而测定蛋白质的pI值。

参考文献：Guo, S., Zhu, X., Jańczewski, D., Lee, S. S. C., He, T., Teo, S. L. M., & Vancso, G. J. (2016). Measuring protein isoelectric points by AFM-based force spectroscopy using trace amounts of sample. Nature nanotechnology , 11 (9), 817-823.

文章来源：https://www.nature.com/articles/nnano.2016.118

本文由LLLucia供稿。

本内容为作者独立观点，不代表材料人网立场。

未经允许不得转载，授权事宜请联系kefu@cailiaoren.com。

欢迎大家到材料人宣传科技成果并对文献进行深入解读，投稿邮箱: tougao@cailiaoren.com.

投稿以及内容合作可加编辑微信：cailiaorenVIP。