【NS精读】远离Bad Blood式骗局——如何实现“滴血验癌”？

引言

还记得几年前闹得沸沸扬扬的“Bad Blood”骗局吗？一家名为Theranos宣称只需一点点血液样本就能检测多达数十种疾病，未来甚至能有望高效检测血液中的癌症标志物。然而，随着数据的不断披露，人们渐渐发现这种检测方式非常不可靠，取血量远远不能满足检测限需求，随后原本前景无限的Theranos公司遭遇资本危机，如今已黯然远离人们的视野。然而，“滴血验癌”真的无法实现吗？血糖仪是一款非常经典的疾病检测器件，只需一点指尖血，就能测量人体血糖水平。但是对于像癌症这类重大疾病来说，单一的检测指标很难作为判断依据，因此多重酶检预览 （在新窗口中打开）测（multiplexed enzymatic detection）必不可少。

然而，由于酶的最优活性条件各不相同，多重检测的实现一直是一个艰巨的科学任务。虽然近年来，基于生物大分子亲和能力的电化学生物传感器在多重酶检测已取得许多研究进展，但是其商业化前景依然不明。最主要的原因是电化学生物传感是基于由电极、样品等组成的闭环电学电路，样品中的生物标记物组分（大多为非检测相关蛋白质）会与电极进行非特异性结合并污染电极，从而减弱电流和灵敏度。而传统的防污涂层，如牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇（PEG）自组装单层虽然可以防止电极污染，但也会阻碍电子输运，使得防污策略陷入两难的境地。因此，开发可靠的防污策略是电化学生物传感器继续发展所亟需解决的挑战。近期，哈佛大学著名的仿生工程学家Donald E. Ingber（通讯作者）等人通过改造电极可以有效防止蛋白质污染，在长达一个月的血液检测中仍然可以维持传感器优异检测性能。该篇研究文章题为“An antifouling coating that enables affinity-based electrochemical biosensing in complex biological fluids”，于2019年11月11日发表于Nature Nanotechnology。

哈佛团队在Nature Nanotechnology发表的关于生物传感器的最新文章 

防污电极制备

首先，让我们来看看在这项工作新型防污电极是如何制备的。如图1a-1c所示，研究人员设计了一种由BSA和导电纳米材料（金纳米线、金纳米颗粒或者碳纳米管）交错而成的三维纳米复合材料。通过混合以及超声-离心作用来均化纳米复合材料，再利用滴涂法（drop-casting）将纳米复合材料滴涂到金电极芯片表面形成防污涂层。由此制得的电极在电化学活性的三铁氰化钾（potassium ferriferrocyanide）溶液进行循环伏安法检测。其中，还原峰和氧化峰之间的电位差值ΔEp和电流密度可以评价电极表面和溶液之间的电子输运动力学，从而反映传感器固液界面的状态和质量。如图1d-1e所示， BSA和BSA/金纳米线涂层都会钝化电极，而BSA/金纳米颗粒和BSA/碳纳米管涂层则能分别保留25%和75%的电流密度，表明纳米颗粒可以有效介导电子输运。当电极与含1%的BSA缓冲液一起孵育（1-d，一天）以测试电极防污性能时，除了BSA/碳纳米管涂层电极外所有电极的电化学性能都经历了衰退；其中，BSA/金纳米颗粒涂层电极表现出宽达0.4V的电位差值，说明由于生物污染造成溶液中铁氰根离子至电极表面的扩散受到限制。为了解决这一扩散限制问题，研究人员将戊二醛添加到纳米复合材料中用以交联BSA分子，从而形成布满导电纳米材料的多孔三维蛋白质基质。在BSA/金纳米颗粒/戊二醛涂层中依然出现明显的电极钝化，研究人员认为金纳米颗粒能够堵塞基质孔。然而，在其他电极中，交联了戊二醛之后的电化学性能都能得到明显的提升。特别是，BSA/金纳米线/戊二醛涂层电极能够观察到具有与裸金电极相似的电化学行为（图1f-1g）。

图1 纳米复合涂层及其电化学表征

为了深入理解这些电极的电化学增强机理，研究人员利用扫描电子显微学（SEM）对涂层的多孔性进行了表征（图2）。SEM图片显示，在纳米复合材料形成过程中，BSA与用于稳定金纳米线的离子表面活性剂进行疏水及静电相互作用，从而在金纳米线附近发生BSA吸附行为。；当BSA与戊二醛进行交联时，这一吸附行为则会在纳米线周围沉积产生多孔类海绵蛋白质基质。由此，研究人员认为BSA/金纳米线/戊二醛涂层中的孔道结构具有纳米电极作用，电活性物种就能实现穿膜输运或者孔扩散行为。相比之下，由于金纳米颗粒的粒径大于孔径，在交联过程中金纳米颗粒不会与BSA基质整合，反倒会堵塞孔道。因此，BSA/金纳米颗粒/戊二醛涂层中的孔结构更小更少，当纳米复合材料厚度增加时，电子和电活性物种输运变得更加困难。

图2 BSA/金纳米线/戊二醛纳米复合材料的表征

防污机制

这一孔道结构不仅能够提高电极的电化学性能，还能赋予BSA/金纳米线/戊二醛涂层防污效果。在交联的BSA基质中，孔道能够筛选排斥尺寸较大的粒子，限制这些粒子的扩散行为，从而封堵它们通往电极表面的路径。一方面，戊二醛能够在具有伯氨的条件下快速反应形成在交联过程中充当结构胶角色的吡啶聚合物。在该项工作中，至少需要5个戊二醛分子形成吡啶聚合物，由此才能在BSA的氨基间形成有效的聚合物交联，并进一步在两个BSA分子间形成连接（linkage）。纳米复合材料中每个BSA的连接数（2、1、甚至更少）决定了产物分别是线性BSA聚合物、BSA二聚体抑或是BSA单体。因此当连接数相似与（甚至高于）活性氨基酸时，能够产生交联度更高的BSA聚合物，同时在这些聚合物表面也会出现过量未反应的戊二醛分子甚至是吡啶聚合物。这些在涂层表面的吡啶聚合物则可以与污染蛋白（fouling proteins）反应，从而堵塞孔道，削弱涂层的防污能力。如图3所示，增加戊二醛的原料比可以显著增加BSA线性聚合物的产量，从而才能形成高度交联的三维基质网络。而另一方面，研究认为蛋白质上连接数的分布呈现离散概率分布。当戊二醛的含量提高时，每个BSA上连接数不仅更高，其概率分布也更广（例如1BSA/1戊二醛的涂层中80%的BSA具有16-28个连接）。这样的结果不仅导致涂层更加异质化，更会压缩孔径，导致电流密度降低和电位差值变大。最后，通过比较测量，研究优选出的BSA/金纳米线/戊二醛涂层（5 mg/mlBSA，1%戊二醛以及≥50 μg/ml金纳米线），其与1%的BSA缓冲液孵育一天后具有最高的电流密度、最小的电位差值以及最低的性能下降程度。

图3 BSA与戊二醛的交联能够影响电极性能

血浆分析

对于临床诊断来说，生物传感器在复杂生物体液中的性能表现是最为重要的评价指标。因此，研究人员将上述优选出的含有BSA/金纳米线/戊二醛涂层的电化学传感器分别与1%的BSA缓冲液、未处理的人血清以及人血浆进行孵育。比较发现，BSA/金纳米线/戊二醛涂层传感器在一个月后依然只有约7%的灵敏度损失，其电流密度与裸金电极相差无几，表现出优异的防污性能（图4a）。在电化学酶夹心检测试验中，电极先后与靶向特异性抗体、目标检测蛋白白介素（IL-6）、偶联有辣根过氧化物酶（HRP）的抗IL-6检测抗体进行孵育（图5），当四甲基联苯胺（TMB）加入时，HRP氧化TMB并在电极涂层表面产生可以被伏安法检测到的电活性产物。如图4b所示，与PEG-SAM涂层电极相比，BSA/金纳米线/戊二醛涂覆的电极能够表现出优异的伏安曲线，表明BSA/金纳米线/戊二醛涂层电极能够轻易检测到IL-6。更深入的检测表明，BSA/金纳米线/戊二醛涂层电极在未处理人血浆中的IL-6检测限可以达到23pg/ml，而PEG-SAM涂层电极则无法在血浆中检测出信号值（图4c）。最后，检测后的电极能够利用甘氨酸盐酸盐进行清洗并储存，经过一周/一月的储存后电流密度的损失率非常小，依然能实现有效的IL-6检测（图4d）。

图4 涂层防污与生物检测性能

图5 纳米复合电极实现体液IL-6检测示意图（图片来源：Nat. Nanotech. 2019, 1089-1090.）

结论

虽然近年来电极的防污研究进展不少，但是这篇文章提出的电极制备方法却异常简单，只需将复合混合物进行滴涂即可。涂层基质中的BSA骨架能够阻止非特异性蛋白吸附，同时允许可溶性的电活性物种能够最大限度地扩散到电极周围。最终，金电极在涂覆BSA/金纳米线/戊二醛纳米复合涂层后电流密度可以保留88%以上，在储存期长达一个月左右的条件下信号损失值只有10%左右，证明这一防污策略是切实高效的。

参考文献：An antifouling coating that enables affinity-based electrochemical biosensing in complex biological fluids

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41565-019-0566-z

本文由nanoCJ供稿。

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