加拿大麦吉尔大学Mater. Horiz.：响应微孔成型生物打印方法制备多孔粘弹性水凝胶

如何快速地3D打印具有细胞尺寸孔径的生物支架？现有的生物墨水打印成型后大多会形成纳米尺寸孔径，远小于细胞的大小，因此往往会阻碍细胞在生物支架内的伸展、迁移、代谢、以及营养物质的输运。另外，有研究表明具有细胞大小孔径的支架能促进细胞的功能。因此3D打印具有细胞尺寸孔径的生物支架，在细胞和组织工程领域具有重要意义。

现有挤出式生物打印技术在打印10微米级别的孔径捉襟见肘(图1)。因为传统的成孔方法（比如冻干处理）没法实现实时细胞打印，而且10微米级的结构对3D打印精度和速度提出很大的挑战。这个方向最近成为一个3D打印领域的热点。新进开发的多孔生物打印方法基于胶束或水相乳液，添加到生物墨水中打印形成多孔结构。这些方法局限于生物墨水的稳定性，导致可打印窗口有限，另外形成的多孔结构的机械强度较低，而且难以调解支架的力学性能（比如粘弹性）。这些问题限制了在生物工程领域的应用。

针对以上问题，加拿大麦吉尔大学李剑宇教授团队首次提出响应微孔成型生物打印方法（Triggered Micropore-Forming bioprinting），利用水凝胶刺激响应的微分相行为实现新型生物支架的快速制造、力学性能的有效调控，并促进细胞活性和功能。该新型生物打印方法可制造高度联通且具有细胞大小孔径的多孔水凝胶，并在低聚合物浓度的条件下首次实现弹性、粘弹性、孔隙三种特性正交调控。

图1：多种生物材料的孔径和粘弹性能（应力松弛减半时间）的关系。

该团队利用壳聚糖pH值从酸性到中性过程中发生微分相的特性来展示TMF打印方法。该生物墨水由负载细胞的壳聚糖（chitosan）和聚乙二醇（PEG）微酸性水溶液组成。其在室温下打印到控制pH值的明胶嵌入式打印支撑物中后，通过温度升高到37℃可融化明胶并提升生物墨水的pH值。Chitosan在pH提升到其pKa值（约6.5）之后会发生微分相行为并引发物理交联形成多孔水凝胶。

图2：使用TMF方法打印多级孔径、粘弹性可调生物支架的流程。

研究发现该凝胶的弹性性能可通过嵌入式打印支撑物的pH值调节，其剪切模量（G’）范围为0.5-27 kPa，横跨三个数量级。若固定打印支撑物的pH而增加墨水中PEG的含量，凝胶的应力松弛减半时间可从10⁴秒调节到10²秒，同时保持剪切模量不变。在孔径的表征上，该团队使用了共聚焦显微镜和扫描电镜两种方式，同时验证了这一TMF方法可产生细胞大小孔径，且孔高度联通。这一研究首次实现了凝胶的弹性、粘弹性、孔隙三种特性的正交调节。该生物墨水系统具有良好的细胞兼容性，且在厚支架中保持较高的细胞存活率。细胞在多孔凝胶内部的迁移速率也显著高于非多孔标准凝胶。

图3：多孔生物支架的机械和结构性能。

该生物墨水在室温下长期稳定，同时具有良好的流变性能便于挤出式打印。通过改变打印速度和压强，同一个30G针头可在120-1500微米范围内调节线宽。通过不同生物墨水的组合，还可制造出具有粘弹性梯度的多孔凝胶。为了展现TMF打印方法和该生物墨水在生物工程上的应用，研究人员首先打印了由人声带成纤维细胞和人气管上皮细胞组成的复合声带结构。其中TMF中的成纤维细胞相比标准墨水更好地在三维环境中展开，上皮细胞也形成了紧密的层状结构。研究人员还将MDA-MB-231癌细胞打印在具有不同粘弹性的凝胶内进行体外癌症建模。实验结果证明癌细胞的增殖和迁移可通过粘弹性调控。该工作对使用多孔凝胶用于组织工程、癌症模型等生物应用提供新思路。

图4：生物打印用于软组织工程和体外癌症模型的创建。

以上成果发表在RSC旗下Materials Horizons期刊 （Triggered micropore-forming bioprinting of porous viscoelastic hydrogels, Materials Horizons, 2020, 10.1039/D0MH00813C）。论文的第一作者为加拿大麦吉尔大学机械工程专业博士生鲍光宇。共同通讯作者为麦吉尔大学李剑宇教授和Luc Mongeau教授，两人皆为Canada Research Chair。

本文由作者团队供稿。