武汉大学张先正Nat. Commun.：基于疫苗的纳米系统用于启动天然免疫和增强肿瘤免疫治疗

【研究背景】

免疫治疗释放患者自身免疫系统在各种不可治愈肿瘤中取得了较好的临床效果。免疫检查点阻断（ICB），特别是以程序性细胞死亡蛋白1或程序性细胞死亡蛋白1（PD1/PDL1）为靶点的药物治疗在黑色素瘤、非小细胞肺癌和三阴性乳腺癌（TNBC）的治疗中取得了满意的疗效。尽管如此，但ICB治疗在临床试验中面临的一个主要问题是反应率极低。即使是黑色素瘤，一种最具免疫原性的肿瘤，只有20-50%的患者受益于ICB治疗。据报道，由于微生物能够引起强大和持久的免疫应答，因此被用于提高癌症治疗的治疗反应率。然而，安全性问题是目前基于微生物治疗的最大难题。例如，由细菌（如细胞因子释放综合征和感染）或病毒（主要是疲劳、发烧和寒战）引起的不良反应，很大程度上限制了它们的临床转化能力。

【成果简介】

近日，在微生物特性和适当的生物安全性的启发下，武汉大学张先正教授团队通过将Cd274的siRNA整合到商业化的人乳头瘤病毒（HPV）L1（HPV16 L1）蛋白中，制备了一种基于疫苗的纳米系统，用于特异性抑制肿瘤PDL1表达。受益于HPV疫苗的优点，这种siRNA负载的纳米系统（siRNA@HPVP）具有良好的生物安全性，提高了抗肿瘤免疫治疗的疗效。HPV16-L1蛋白通过I型干扰素途径激活先天免疫，与ICB联合治疗具有有效的抗癌作用。对于可切除和不可切除的乳腺肿瘤，纳米系统可减少71%的肿瘤复发，延长67%的小鼠存活期。最重要的是，该纳米系统在不同突变的肿瘤荷瘤小鼠中，治疗响应率也非常高。这种基于疫苗的纳米系统引发的强烈免疫刺激可能是一种显著改善当前ICB免疫治疗的方法。该文章近日以题为“A vaccine-based nanosystem for initiating innate immunity and improving tumor immunotherapy”发表在知名期刊Nature Communications上。

【图文导读】

图一、siRNA@HPVP的作用原理和表征

（a）1097人类乳腺肿瘤和114个来自UALCAN的准癌组织肿瘤免疫调节相关基因的表达。

（b）CD3E/IRF7表达与TCGA乳腺肿瘤患者生存之间的相关性。

（c）siRNA@HPVP系统设计和功能过程的示意图。

（d）三个siRNA序列（100 nmol mL^-1）沉默4T1细胞后Cd274转录的PCR分析。

（e）在HPVP与siRNA的不同质量比下，siRNA@HPVP的凝胶电泳。

（f）siRNA@HPVP的低温透射电镜图像。

（g）流式分析在4T1细胞和4T1^Itga6-细胞中siRNA@HPVP的摄取。

图二、体外抗原呈递细胞（APCs）激活

（a）脾细胞对4T1细胞的体外杀伤作用（效应物-靶比值10:1）。

（b）用不同siRNA@HPVP形式（siRNA1@HPVP、siRNA2@HPVP或siRNA3@HPVP）、HPVP或新鲜培养基共同孵育24小时后，在CD11c⁺细胞共孵育成熟DC（CD80⁺CD86⁺）的FACS数据。

（c）不同处理后DCs中IFN-α和IFN-γ的转录丰度。

（d-e）FACS数据显示巨噬细胞（CD11b⁺CD80^-）经过不同处理后6小时表型和活化比例。

（f）不同处理后RAW 264.7巨噬细胞培养液中细胞因子水平的变化。

图三、siRNA2@HPVP的肿瘤聚集和抗肿瘤能力

（a）注射HPVP对4T1荷瘤小鼠体内肿瘤靶向能力的研究。

（b）用于评估PDL1抑制siRNA1@HPVP、siRNA2@HPVP和siRNA3@HPVP效果的离体免疫荧光图像

（c）生物发光法原位检测siRNA2@HPVP对4T1肿瘤治疗后的先天免疫反应。

（d）对不同治疗组在小鼠皮下乳腺肿瘤模型上的体内抗癌效果评估。

（e）FACS分析用于测量PBS或siRNA2@HPVP治疗小鼠肿瘤中PDL1蛋白的表达。

（f）不同治疗后Ki67肿瘤细胞的定量分析。

（g）不同治疗后淋巴结内成熟DCs（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）和肿瘤浸润性细胞毒T细胞（CD3⁺CD8⁺T细胞）的FACS数据。

（h）FACS分析法测定不同治疗后肿瘤内M1/M2巨噬细胞比值。

（i）不同处理后12小时小鼠血清IFN水平的变化。

图四、先天免疫的激活机制

（a）在肿瘤内注射3天后，用siRNA2@HPVP或aPDL1在4T1肿瘤中识别差异表达的基因。

（b）GeneMANIA用于预测免疫过程GO术语中差异基因之间的基因相互作用。

（c）KEGG浓缩分析siRNA2@HPVP治疗引起的生物效应所涉及的途径。

（d）不同治疗方法对4T1肿瘤Tlr7、Cxcl9、Infb1、Ifngr1和Ifng基因转录丰度的PCR分析。

（e）siRNA2@HPVP激活先天免疫的可能机制的原理图。

（f）瞬时表达TLR同型二聚体和ELAM-Luc报告质粒的HEK-293细胞证明siRNA2@HPVP介导的免疫反应与TLR7相关。

（g）抗IFNAR1抗体阻断Ⅰ型IFN途径抑制siRNA2@HPVP治疗。

（h）用免疫荧光染色法定量分析不同治疗方法对4T1肿瘤T-bet（左）和CD4（右）表达的影响。

图五、可切除和不可切除肿瘤模型的治疗效果

（a）评估siRNA2@HPVP治疗的抗癌效果的不同肿瘤模型。

（b）活体生物发光图像对原发性肿瘤切除后4T1肿瘤的复发和转移的示踪。

（c）原发性肿瘤切除后可切除小鼠乳腺肿瘤模型的病变情况。

（d）不同处理40天后脾脏组织中T_EM细胞（CD8⁺CD44⁺CD62L^-）的比例。

（e）体内生物发光图像显示各种治疗方法的抗转移作用。

（f-g）静脉注射4T1细胞后21天肺组织转移灶定量计数及H&E染色切片。

（h）不同治疗方法对原位乳腺癌荷瘤小鼠体内生物发光的影响。

（i）具有代表性的CT图像用于各种治疗后乳腺肿瘤骨转移的可视化。

（j）不同治疗方法对原位乳腺癌荷瘤小鼠生存曲线的影响。

图六、siRNA2@HPVP的治疗响应率

（a）CRISPR-Cas9介导的大规模基因突变的Mlh1基因敲除示意图。

（b）获得的7个突变细胞系的SNP（左）和Indel（右）分析。

（c）作为Mlh1基因敲除后细胞突变的分析。

（d-h）用aPDL1+PTX或siRNA2@HPVP+PTX静脉注射治疗的5种不同乳腺肿瘤模型的肿瘤生长曲线（左）、肿瘤浸润性T细胞比例（中）和生存曲线（右）。

（i）弧图和热图显示每个个体的肿瘤内免疫指标（CD3、CD4、CD8、Foxp3、IL2、T-bet和IFN-γ）。

【结论展望】

综上所述，制备的含有PDL1封锁siRNA（siRNA@HPVP）的HPV仿病毒纳米粒子，能进行有效的抗癌免疫治疗，且具有较高的反应率。siRNA@HPVP通过疫苗和α6整合素对肿瘤细胞的主动靶向作用，显示了良好的肿瘤蓄积能力。更重要的是，HPVP有效地激活了先天免疫，配合肿瘤的ICB治疗。术前siRNA2@HPVP治疗证明可减少可切除乳腺癌的术后复发和远端转移。在不可切除的肿瘤模型中，与临床使用的治疗方案相比，siRNA2@HPVP还延长了无进展生存和总体存活率。此外，当结合PTX的化疗，siRNA2@HPVP在一系列异基因肿瘤模型上表现出优异且稳定的治疗反应率，优于III期临床试验（aPDL1加PTX）的治疗。临床使用的疫苗和ICB之间的这种结合可能会成为目前的癌症疗提供新的方法。

文献链接：A vaccine-based nanosystem for initiating innate immunity and improving tumor immunotherapy (Nat. Commun., 2020, DOI: 10.1038/s41467-020-15927-0)

课题组简介：

张先正，博士，教授，武汉大学博士生导师，长江学者特聘教授、国家杰出青年基金获得者、国家“万人计划”科技创新领军人才、享受国务院政府特殊津贴。国际生物材料科学与工程学会联合会(IUSBSE) Fellow、英国皇家化学学会Fellow (FRSC)、中国生物材料学会青年科学家奖获得者、科技部中青年科技创新领军人才。

张先正教授长期从事生物医用高分子/多肽的研究，包括肿瘤诊断与治疗、药物传递、基因治疗等，研究成果获教育部自然科学一等奖1项、二等奖1项、湖北省自然科学一等奖1项。已在Nat. Biomed. Eng.、Prog. Polym. Sci.、Nat. Commun.、Sci. Adv、Adv. Mater.、JACS、Angew. Chem. Int. Ed.、Nano Lett.、ACS Nano、Adv. Func. Mater.、Biomaterials、Small等期刊发表SCI论文500多篇，其中IF大于10的160多篇。论文SCI他引17000多次，H因子70。2015年-2019年连续入选中国高被引学者榜单（材料科学）。参与撰写学术专著4部（共4章）。申报国内外专利20余项。担任中国生物材料学会理事会常务理事，中国生物材料学会医用高分子材料分会副主任委员、中国材料研究学会高分子材料与工程分会常务理事，中国化学会高分子学科委员会委员等。Materials Today Chemistry 主编、Materials Today、Molecular Pharmaceutics、中国科学-化学、高分子学报、化学学报、功能高分子、高分子材料科学与工程、胶体与聚合物等国内外期刊编委等。

课题组网站：http://xzzhang.whu.edu.cn/index.html

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