中科院朱明昭团队Nat. Nanotech.报道：双靶向铁蛋白纳米疫苗引发针对慢性乙型肝炎的治疗性抗体反应

【背景介绍】

乙型肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的全球性健康问题，HBV会攻击肝脏，从而导致急性和慢性疾病。据估计，目前全球有2.57亿人是HBV慢性携带者，并有发展为肝病、肝硬化和肝细胞癌的高风险。虽然常规的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）疫苗接种可在大多数健康的接种人群中诱导保护性抗体，并有效降低新的HBV感染的发生率，但是HBsAg在临床动物模型或CHB感染患者中均无法诱导有效的抗体反应。因此，非常需要一种消除和根除CHB的有效治疗策略。

对比HBsAg，HBV大表面抗原的preS1结构区域被认为是治疗性疫苗开发的理想免疫原候选物。目前已证明针对preS1的单克隆抗体（MA18/7和KR127）在体内外均能有效抑制HBV感染。同时，抗-preS1还可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和吞噬作用消除HBV⁺细胞。此外，在CHB患者中，对preS1的免疫耐受性似乎比对HBsAg的免疫耐受性低得多。研究显示，preS1抗原疫苗接种而非HBsAg疫苗在HBV携带者小鼠中引起中和性治疗抗体应答。在自然感染和主动接种中均发现，preS1似乎不是有效的抗体诱导剂。因此，如何提高preS1的免疫原性以增强治疗性抗体反应是当前开发基于preS1的治疗性疫苗的关键问题。

【成果简介】

基于此，中国科学院生物物理所的朱明昭研究员（通讯作者）团队报道了一种铁蛋白纳米粒子疫苗，可以将preS1递送至特定的骨髓细胞，包括SIGNR1⁺树突状细胞（激活T滤泡的辅助细胞）和与淋巴窦相关的SIGNR1⁺巨噬细胞（可以激活B细胞）。这种纳米颗粒疫苗可诱导高水平且持久的抗-preS1反应，从而在慢性HBV小鼠模型中实现有效的清除病毒和部分血清学转化，为功能性治愈慢性乙型肝炎提供了一种有希望的可转化疫苗接种策略。研究成果以题为“Dual-targeting nanoparticle vaccine elicits a therapeutic antibody response against chronic hepatitis B”发布在国际著名期刊Nature Nanotechnology上。

【图文解读】

图一、铁蛋白NP疫苗的分子设计和表征
（a）基于铁蛋白的疫苗递送载体的示意图；

（b）SpyTag-铁蛋白NPs的尺寸排阻色谱；

（c）在4^oC下，以1：0.5、1：1和1：2摩尔比在SpyTag-铁蛋白和SC-preS1的共价连接并进行过夜的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；

（d）铁蛋白NP-preS1的尺寸排阻色谱；

（e）SpyTag-铁蛋白NP和铁蛋白NP-preS1的TEM图和2D重建；

（f）在第21天疫苗免疫时，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）分析抗-preS1的应答；

（g）免疫后抗-preS1水平的动力学；

（h）比较结合疫苗和未结合疫苗对抗-preS1的应答；

（i）利用ELISA检测抗preS1 IgG对疫苗免疫的亲和力；

（j）第21天，铁蛋白NP-preS1疫苗或SC-preS1免疫小鼠的血清中preS1特异性IgG1和IgG2c的滴度。

图二、铁蛋白NP-preS1疫苗对HBV的保护性免疫
（a）在第0天和第14天用200 pmol铁蛋白NP-preS1疫苗或等摩尔SC-preS1可溶性抗原、30 μg CpG-1826皮下免疫处理的WT C57BL/6小鼠；

（b）利用ELISA检测AAV-HBV1.3感染后的preS1血清水平；

（c）在第35天，通过实时PCR定量血清HBV DNA水平；

（d-f）在从铁蛋白NP-preS1或SC-preS1免疫小鼠或WT小鼠收集的免疫血清中，将HepG2-hNTCP细胞与1×10⁷ vg HBV孵育。

图三、铁蛋白NP-preS1作为治疗性疫苗
（a）给C57BL/6小鼠静脉注射1×10¹⁰ vg AAV-HBV1.3病毒。

（b-d）利用ELISA测定血清抗preS1（b）、preS1抗原（c）和HBsAg（d）的水平；

（e）第147天时，测定血清HBV DNA、HBsAg和抗HBs水平；

（f）第147天时，对肝细胞中乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的免疫组织进行化学染色；

（g）第147天时，利用实时PCR对肝脏中的HBV cccDNA进行定量分析；

（h）第147天时，测得收集血清中的谷氨酸-丙酮酸转氨酶（ALT）和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（AST）。

图四、铁蛋白NP疫苗靶向不同的APCs
（a）给C57BL/6小鼠皮下注射2 nmol铁蛋白NP-eGFP；

（b-c）C57BL/6小鼠皮下注射2 nmol铁蛋白NP-eGFP或等摩尔eGFP-SpyTag；

（d）10天后，注射CLL或对照脂质体（CON），分析DC或CD11c-CD11b⁺巨噬细胞对铁蛋白NP-eGFP的捕获；

（e）在CLL或CON治疗10天后，铁蛋白NP-eGFP在pLNs中蓄积2 h后，通过免疫荧光显微镜确定注射剂量。

图五、铁蛋白NP疫苗诱导有效的Tfh和GC反应
（a）用1×10⁷ Thy1.1+ OT-II脾细胞过继转移免疫的Naïve WT Thy1.2 C57BL/6小鼠；

（b）在免疫的第63天，通过流式细胞术分析来自iLN的GC B细胞；

（c）用抗-B220、抗-GL7和DAPI对iLN的冷冻切片染色；

（d-e）免疫接种12 h后，利用rDC（CD103^-）、miDC（CD103⁺）、CD169⁺巨噬细胞（CD11c-CD11b⁺CD169⁺）和F4/80⁺巨噬细胞（CD11c-CD11b⁺CD169-F4/80⁺）dLNs与未经处理的OT-II T细胞共孵育；

（f）流式细胞术分析证实利用DT处理的CD11c-DTR骨髓嵌合小鼠的iLN中的DC消耗；

（g）免疫后第10天，在CD11c缺失的小鼠中检测到PreS1特异性IgM和IgG反应。

图六、B细胞激活和抗体产生需要的SIGNR1⁺巨噬细胞
（a）在f.p.的第3天后，从pLNs中筛选出WT小鼠中的免疫接种，rDC、miDC、SIGNR1⁺巨噬细胞和F4/80⁺巨噬细胞，并与MD4 B细胞孵育；

（b-d）在免疫铁蛋白NP-preS1疫苗之前，用PBS或抗CSF1R处理野生型小鼠；

（e）免疫后第3天，WT和Cxcr5^-/-小鼠的iLN中SIGNR1⁺细胞的分布；

（f）在WT：Cxcr5^-/-混合骨髓嵌合小鼠中免疫CpG-1826后5 d，iLNs中WT SIGNR1⁺细胞（CD45.1）或Cxcr5^-/-SIGNR1⁺细胞（CD45.2）的显微镜观察；

（g）从注射的f.p.注射的WT或Cxcr5^-/-小鼠的脾脏中分选SIGNR1⁺巨噬细胞。

【小结】

综上所述，本文的数据表明，在小鼠HBV模型中，通过协调双靶向SIGNR1⁺树突状细胞和LNs中的巨噬细胞，基于铁蛋白NP的preS1疫苗表现出高效的抗体应答，既具有预防作用，又具有治疗作用。该研究可能为今后CHB治疗的转化研究提供一个良好的选择和新思路。

文献链接：Dual-targeting nanoparticle vaccine elicits a therapeutic antibody response against chronic hepatitis B（Nature Nanotechnology, 2020, DOI: 10.1038/s41565-020-0648-y）

通讯作者简介

朱明昭，中国科学院生物物理研究所，感染与免疫院重点实验室，研究员，中国科学院大学岗位教授，博士生导师，中国科学院“百人计划”引进海外杰出人才。主要从事淋巴组织微环境和T细胞发育和应答，疫苗免疫学等方面的研究。一方面，揭示了淋巴组织微环境多种基质细胞发育和功能的调控机制，揭示了淋巴组织微环境对T细胞发育和应答的影响和作用机制，揭示了T细胞发育和应答的表观遗传调控机制；另一方面，开发了基于SpyTag/SpyCatcher的点击疫苗技术，设计了一系列基于纳米胶束和铁蛋白纳米颗粒等载体、靶向淋巴结和抗原呈递细胞的新型点击疫苗和纳米疫苗，应用于肿瘤和传染病的免疫预防和治疗研究。研究成果发表于Nature, Nature Nanotechnology，Nature Communications, Cell Reports, Cell Discovery, Journal of Immunology, Oncoimmunology, Nanomedicine等杂志。

本文由CQR编译。

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