湖大谭蔚泓院士团队JACS: 利用生物正交化学和前药设计构筑新型癌症化学动力治疗新策略

【背景介绍】

通过研究发现，几乎所有类型的细胞都会产生一类具有反应活性的物质—自由基，其是低水平下各种生物过程中必不可少的管理者。在近十年里，科研人员进行了大量的研究以探索自由基在癌症等疾病发展中的作用。研究发现，癌细胞在整个生命周期中会产生过量的自由基（主要是过氧化氢（H₂O₂）），通过代谢重编程促进癌细胞的快速增殖、转移等。然而，当自由基含量超过自由基水平的阈值时，会对细胞产生不可逆的氧化损伤并最终导致其死亡。因此，针对癌细胞中失控的氧化还原稳态发展起来的化学动力学疗法（CDT）被广泛研究，以期望对多种癌症有更好的治疗效果。

目前，虽然已开发了多种CDT策略用于癌症治疗，但是它们主要依靠经典的Fenton或Haber-Weiss反应，即利用过渡金属将内源性低反应活性的H₂O₂转化为羟基自由基（^.OH），进而杀死癌细胞。然而，这些过程存在两个关键的限制因素：（1）高反应速率的Fenton和Haber-Weiss反应需要非常低的pH值（pH=2-4），而肿瘤微环境（TME）呈现弱酸性，难以满足要求；（2）肿瘤中H₂O₂水平存在异质性，且随着反应的消耗导致治疗效果显著降低。此外，癌细胞会产生大量的抗氧化剂，如谷胱甘肽（GSH），以抵抗自由基引起的应激损伤，对CDT疗效的提高带来了障碍。因此，为获得良好的治疗效果同时降低毒副作用，理想的化学动力制剂应满足以下特征：（a）在肿瘤处靶向富集，而对正常氧化还原信号不会产生明显的影响；（b）温和的、空间可控的化学反应过程，从而定向释放高活性的自由基；（c）减少反应过程对肿瘤内源性活性物质的依赖性；（d）能同时消耗肿瘤内抗氧化剂；（e）具有良好的生物相容性、生物可降解性和质量控制。

【成果简介】

近日，湖南大学谭蔚泓院士和刘艳岚教授所在团队首次报道了通过结合生物正交化学和前药设计两个概念，创建了一种新型核酸适体-药物偶联物（ApDC）：核酸适体-前体药物偶联物（ApPdC）胶束，能够特异性识别癌细胞和并通过自循环放大的方式在癌细胞内原位产生有毒自由基。ApPdC胶束包含以下三个部分：识别癌细胞的核酸适体、Fe2+可激活的四恶烷（T）的自由基前药碱基，以及能够响应TME并提供Fe²⁺用于原位激活T的血红素。首先，不同于传统的胶束，作者设计的前药中包含的疏水性前药碱基不仅可以触发核酸适体自组装成刚性的多组分胶束结构，而且还可以通过生物正交反应形成大量的自由基，从而显著提高药物碱基的负载量并降低毒副作用。

其次，ApPdC胶束在生理条件下处于静默状态，但通过受体介导的癌细胞内化后会引发级联的生物正交反应。负载的血红素（Fe³⁺）被细胞内GSH还原成血红素（Fe²⁺），从而触发T活化，进而产生基于C的有毒自由基，而这一过程不依赖于肿瘤酸度或H₂O₂的含量。此外，血红素能够消耗癌细胞内GSH，进一步降低了癌细胞的抗氧化能力，从而发挥协同治疗作用。同时，产生的血红素（Fe²⁺）会导致癌细胞中Fe²⁺离子含量的升高，进一步活化ApPdC胶束中的前药碱基，通过自循环的方式促进毒性C基自由基的累积。此外，ApPdC可通过亚磷酸酰胺化学在DNA合成仪上自动合成，因此可以精准地控制前药碱基的偶联位点和数量，具有优良的质量控制性能，有利于未来的临床转化。总之，该生物正交化学和前药设计的组合策略可以扩展到其它核酸适体，从而构建出一系列ApDC用于各种癌症的靶向治疗。同时，该工作也为自由基相关的分子机制奠定了重要基础。研究成果以题为“Molecular Self-Assembly of Bioorthogonal Aptamer-Prodrug Conjugate Micelles for Hydrogen Peroxide and pH-Independent Cancer Chemodynamic Therapy”发布在著名期刊J. Am. Chem. Soc.上。

【图文解读】

图一、基于生物正交的ApPdC胶束用于癌细胞自循环和原位扩增有毒自由基的示意图

图二、ApPdC的合成与分子组装及其表征
（A）“T”合成的示意图；

（B）（1）游离AS1411、（2）Ap-6G-“T”和（3）Ap-6G-H-“T”的凝胶电泳分析；

（C-D）Ap-6G-“T”和Ap-6G-H-“T”的DLS分析、AFM成像和Zeta电位。

图三、游离核酸适体和不同ApPdC胶束在血清和核酸酶中的稳定性
（A-B）琼脂糖凝胶分析游离核酸适体和不同ApPdC胶束在FBS中的降解速率；

（C-D）琼脂糖凝胶分析游离核酸适体和不同ApPdC胶束在核酸酶中的降解速率。

图四、激活机制
（A-B）游离Fe²⁺或血红素（Fe²⁺）介导的前药碱基“T”的激活机制；

（C-D）利用DEPMPO作为自由基捕获剂，在游离Fe²⁺或由连二亚硫酸盐还原产生的血红素（Fe²⁺）活化下，由“T”产生的自由基的ESR测量。

图五、癌细胞识别和原位产生有毒自由基
（A）细胞流式仪分析不同的ApPdC和非靶向胶束在HepG2细胞中的结合能力；

（B）共聚焦荧光成像分析ApPdC和非靶向胶束在HepG2细胞中的结合能力；

（C）游离核酸适体和ApPdC胶束的溶酶体共定位。

图六、测定不同处理后HepG2细胞中的自由基水平
（A）细胞流式仪分析不同处理后HepG2细胞中的自由基水平；

（B）共聚焦荧光成像显示不同处理后HepG2细胞中的自由基水平。

图七、对癌细胞毒性的协同作用
（A-B）用Ap-6G-“T”，Ap-6G-H-“T”和相应的非靶向胶束处理的HepG2细胞的细胞存活率；

（C）钙黄绿素-AM和碘化丙啶（PI）双染色方法分析Ap-6G-“T”，Ap-6G-H-“T”或相应的非靶向胶束处理的HepG2细胞的活性；

（D-E）用Ap-6G-2“T”、Ap-6G-H-2“T”或相应的非靶向胶束处理后HepG2细胞的细胞存活率。

【小结】

综上所述，作者成功地合成了一种新的靶向抗癌药物，该药物通过结合前药和生物正交化学来靶向调节氧化还原稳态失调的癌细胞，用于癌症靶向化学动力学治疗。通过全面的机制研究，以提高对ApPdC胶束的癌细胞特异性激活和治疗活性的基本认识。研究发现，ApPdC胶束中的前药碱基可被细胞内Fe²⁺激活，从而引发级联的生物正交反应，原位产生以毒性碳自由基。此外，强疏水性前药碱基允许血红素被负载在ApPdC胶束中。这种产生自由基的过程不依赖于强酸性pH或内源性H₂O₂，并且同时通过消耗GSH削弱癌细胞的抗氧化能力。以AS1411为代表，作者系统评估了ApPdC胶束对癌细胞自由基特异性调节的潜力。尽管ApPdC胶束在细胞水平显示了良好的治疗效果，后续工作仍需要进一步研究其在体内的药代动力学和ApPdC胶束的抗癌效果，以更好地说明它们在癌症治疗方面的潜力。此外，ApPdC胶束对正常细胞或组织的长期安全性问题也需要进一步探索。总之，该研究为开发新型有效的ApPdCs、特异性治疗多种晚期癌症奠定了基础。

文献链接：Molecular Self-Assembly of Bioorthogonal Aptamer-Prodrug Conjugate Micelles for Hydrogen Peroxide and pH-Independent Cancer Chemodynamic Therapy（JACS, 2019, DOI: 0.1021/jacs.9b10755）

通讯作者简介

谭蔚泓，美国密西根大学物理化学博士，中国科学院物理化学硕士，湖南师范大学化学学士。现任中国科学院肿瘤与基础医学研究所所长，中国科学院大学附属肿瘤医院教授。兼任上海交通大学分子医学研究院院长，湖南大学化学化工学院、生物学院教授。谭蔚泓教授的主要研究方向是生物分析化学、化学生物学和分子医学。他在国际国内知名学术刊物上发表学术论文650余篇，H-index 138，引用近64,500多次。2014-2019连续六年入选汤森路透全球高被引研究人员名单。研究成果获2018年美国化学会“光谱化学分析奖”，2018年何梁何利基金科学与技术奖，2019年匹兹堡分析化学成就奖，2019年生物分析化学杰出贡献奖。2005年当选美国AAAS Fellow，2015年当选中国科学院院士，2016年当选发展中国家科学院院士。

刘艳岚，化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学化学化工学院教授，分子科学与生物医学实验室，博士生导师，国家千人计划“青年项目”入选者。主要从事多功能探针的设计合成及在重大疾病的活体成像及分子靶向干预研究。相关工作以第一作者及通讯作者身份发表在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Rev.、PNAS、Adv. Mater.等国际权威期刊上。文章总他引次数5000多次。多篇文章入选“ESI高被引文章”。

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