李亚平&于海军Nano Lett.：前药囊泡用于肿瘤的光动力免疫治疗

【研究背景】

免疫检查点阻断（ICB）治疗在转移性或晚期肿瘤的临床治疗中引起了广泛关注。ICB疗法可以诱导针对肿瘤消退的全身保护性免疫应答，但是由于肿瘤细胞的免疫原性低和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的肿瘤内浸润不足，只有一部分癌症患者对目前的ICB治疗有反应。研究者们目前已开发出包括化学疗法、放射疗法和光动力疗法（PDT）在内的几种治疗方式来引发抗肿瘤免疫反应。PDT可以诱导活性氧（ROS）生成，从而触发免疫原性细胞死亡（ICD）级联反应。经历ICD的肿瘤细胞在细胞膜表面表达钙网蛋白（CRT），并分泌高迁移率组蛋白1（HMGB1）蛋白和三磷酸腺苷（ATP）募集CTL。此外，一些研究表明，PDT可通过上调促炎因子（如热休克蛋白70（HSP70）和转录因子核因子κB（NF-kB）的表达来触发免疫反应。

【成果简介】

近日，中科院上海药物研究所李亚平研究员和于海军研究员联合证明了通过抑制吲哚胺2，3-二加氧酶1（IDO-1）可以克服免疫耐受。作者通过整合PEG化光敏剂（PS）和IDO-1抑制剂的还原敏感性前药，合理设计了可在肿瘤微环境中脱落的前药囊泡。前药囊泡在血液循环中是惰性的，而它们通过MMP-2介导的PEG裂解特异性地聚集在肿瘤部位，从而实现了荧光成像引导的PDT。与单独的PDT相比，前药-囊泡介导的联合免疫疗法在CT26大肠和4T1乳腺免疫功能正常的小鼠模型中均增强了抗肿瘤免疫力。前药囊泡显著抑制了肿瘤复发。该文章近日以题为“Sheddable Prodrug Vesicles Combating Adaptive Immune Resistance for Improved Photodynamic Immunotherapy of Cancer”发表在知名期刊Nano Lett.上。

【图文导读】

图一、纳米材料制备及细胞作用过程示意图

（a）用于组合光动力免疫疗法的MMP-2响应脱落和GSH活化的前药囊泡的示意图；（b）EAPV介导的光动力免疫治疗的机制。

图二、EAPV的化学物理表征

（a）HPLC色谱图和（b）在37°C下与MMP-2（2.5 μg/mL）孵育后PGGP的降解率。（c）由DLS确定的EAPV和PV的水动力粒径分布。（d）EAPV和PV的紫外-可见光谱。（e）EAPV和PV的荧光性质；插图显示PBS（上图）或SDS（下图）中EAPV的NIR荧光成像。（f）分别与2.5 μg/mL MMP-2孵育0、4和24 h后，EAPV的代表性TEM图像（比例尺为100 nm）。（g）EAPV的多分散性指数（PDI）和（h）流体动力学直径的变化与孵育时间和MMP-2浓度的关系。

图三、体外EAPV的细胞内摄取和光活性

在PPa浓度为2.0 μM的条件下用（a）CLSM和（b）体外流式细胞术分析CT26细胞中EAPV的细胞内摄取。（c）CLSM分析CT26细胞MCS中的EAPV和PV分布。（d）沿箭头方向的CT26细胞MCS中EAPV和PV的荧光强度分布图和（e）2.5-D热图。（f）流式细胞术分析CT26细胞中EAPV产生胞内ROS。（g）将CT26细胞与NLG-919，NPC，p-lysoPC或EAPV孵育48小时后的细胞活力。（h）EAPV在体外CT26细胞中的光毒性。（i）PDT触发的CRT暴露和（j）体外CT26细胞的HMGB1外排。（k）体外DC成熟测定的示意图。（l）EAPV诱导的DC体外成熟。

图四、体内前药囊泡的生物分布和药代动力学特征

（a）静脉注射EAPV和游离NLG919后，Balb/c小鼠血浆NLG919的浓度-时间曲线。（b）CT26荷瘤小鼠体内EAPV和PV分布的IVIS图像。（c）注射后24小时检查的肿瘤部位的标准化荧光强度。（d）注射后24小时检查的离体荷瘤小鼠主要器官中EAPV和PV分布的IVIS图像。（e）主要器官的标准化荧光强度。（f）注射后4 h检查CT26肿瘤切片中EAPV分布的CLSM图像。

图五、体内抗肿瘤作用和免疫学指标分析

（a）EAPV治疗策略的示意图。（b）4T1和（c）CT26肿瘤模型的肿瘤体积变化。（d）4T1荷瘤小鼠和（e）CT26荷瘤小鼠的生存曲线。（f）体内CT26肿瘤表面CRT表达的免疫荧光和（g）HMGB1外排在CT26肿瘤中的免疫荧光。（h）肿瘤引流淋巴结的照片，以及（i）在肿瘤引流淋巴结中的成熟的DC的比率。（j）肿瘤组织中肿瘤内浸润T淋巴细胞的比率。（k）治疗后3天检查的IFN-γ⁺ CTLs 的代表性流式细胞曲线。

图六、EAPV诱导的体内ICD

（a）IDO-1的免疫组织化学染色。（b）蛋白质印迹分析CT26肿瘤中IDO-1的表达，以及（c）体内肿瘤组织中GAPDH标准化的IDO-1的表达。（d）IFN-γ孵育后体外对CT26细胞中IFN-γ诱导的IDO-1表达进行WB分析，以及（e）CT26细胞中GAPDH归一化IDO-1表达。（f）不同治疗后CT26肿瘤组织中的Kyn/Trp比（第一次治疗后12小时收获肿瘤组织）。（g）在肿瘤治疗结束时检查的肿瘤组织中Tregs的流式细胞曲线。（h）肿瘤组织中CTLs与Tregs的比率。（i）前药囊泡进行的光动力免疫治疗的示意图。

【结论展望】

综上所述，本研究合成了聚乙二醇化光敏剂和NLG919前药（NPC），制备了可切断的前药囊泡（EAPV），该囊泡具有均一的粒径分布，良好的血清稳定性以及MMP-2和GSH双重响应能力。EAPV还具有很强的摄取能力，并能深入肿瘤组织。体内和体外实验证明，EAPV可以有效产生ROS，诱导肿瘤细胞的ICD，并最终增强DC对肿瘤细胞的免疫识别。体内抗肿瘤结果显示，在CT26皮下肿瘤模型中EAPV的抗肿瘤功效比在4T1肿瘤中更好。在不同肿瘤模型中的不同治疗潜力突显了IDO-1生物标记物对高效光动力免疫疗法的重要性。

文献链接：Sheddable Prodrug Vesicles Combating Adaptive Immune Resistance for Improved Photodynamic Immunotherapy of Cancer (Nano Lett., 2019, DOI: 10.1021/acs.nanolett.9b04012)

李亚平研究员：药剂学博士，研究员，国家基金委创新群体学术带头人，杰出青年基金获得者，973首席科学家，国家万人计划、中科院百人计划专家，现任中科院上海药物研究所药物制剂研究中心主任。研究方向包括纳米载药系统抗肿瘤转移及克服肿瘤耐药，核酸药物非病毒载体及其导入系统，以及创新药物与高端制剂的研究开发。在Nat Med、Chem Soc、Adv Mater、Sci Immunol、Nat Commun等国际重要学术期刊上发表高质量论文200余篇（其中IF＞10的论文80余篇）。已获得新药证书9本, 临床批件13件（创新药物制剂临床批件10件）; 申请专利82件(授权42件)。

于海军研究员：于海军研究员长期致力于新型纳米载药系统研究并取得了突出成绩：1）构建了系列新型纳米载药系统，激活肿瘤免疫效应并逆转肿瘤免疫抑制微环境，有效抗肿瘤转移和复发；2）构建了系列快速响应纳米载药系统克服肿瘤组织和细胞生理屏障，提高药物转运效率，显著改善肿瘤化疗和RNA干扰治疗效果；3）从分子、细胞和组织层面揭示了上述纳米载药系统抗肿瘤耐药和转移的关键作用机制。曾获得科技部中青年科技创新领军人才和中国药学会-赛诺菲青年生物药物奖等科研奖励及荣誉。主持国家自然科学基金“优秀青年基金”、面上项目和科技部“973”课题等多项科研项目。

本文由大兵哥供稿。

欢迎大家到材料人宣传科技成果并对文献进行深入解读，投稿邮箱：tougao@cailiaoren.com

投稿以及内容合作可加编辑微信：cailiaokefu