新加坡国立大学刘斌教授Angew. Chem. Int. Ed.:吞噬体内细菌的光学诊疗

【引言】

一百多年来，人们对人类健康具有破坏性后果的致病性感染进行了广泛的研究。抗击细菌感染的一个主要挑战是 无法在细菌感染的早期阶段即治疗最有效时以足够的灵敏度和准确度检测这些感染。目前用于细菌感染的诊断技术依赖于活组织的培养，组织学分析和外周血的取样，其具有低灵敏度，耗时和处理复杂的特点。这些技术只能在出现明显的全身性组织损伤时诊断细菌感染，这给治疗带来了挑战。使问题复杂化的是，一些细菌能够在宿主细胞内存活，这使得现有可用的治疗无效，导致复发或慢性感染。由于检测中的挑战和对传统抗微生物疗法的高耐药性，这些顽固性感染难以治疗。为此，开发用于检测和消除细胞内细菌的新策略是非常有吸引力的，这将对抗细菌感染的治疗具有显着影响。

使用常规方法进行有效的细胞内细菌检测和消除的挑战促进了基于纳米医学策略的发展。最近，抗体-抗生素缀合物，细胞介导的药物递送载体和甲氨蝶呤-肽缀合物，对于细胞内细菌感染治疗是可行的。尽管这些方法可减少细胞内细菌，但仍需要更有效的试剂来有效地检测和消除哺乳动物细胞中的致病细菌。一旦细菌被巨噬细胞吞噬，这些细菌中的一些能够存在于不同的亚细胞位置，例如吞噬体和液泡。因此，需要具有成像和杀灭特性的新型造影剂，其能够特异性地定位于具有细菌的亚细胞位点。免疫细胞，尤其是巨噬细胞，通常可以通过激活多种生物途径快速响应细菌感染。因此，基于巨噬细胞的固有特征，用于细菌感染检测和细胞内细菌消除的生物探针是很有希望的研究方向。

【成果简介】

近日，新加坡国立大学刘斌教授课题组构建了基于AIEgen-肽的荧光生物探针（即PyTPE-CRP），其可特异性识别casp-1，用于细菌感染成像和细胞内细菌杀伤。PyTPE-CRP由两个部分组成，即1）酶可裂解肽（NEAYVHDAP）作为响应部分，其可以通过casp-1在氨基酸Asp和Ala之间裂解；和2）AIE荧光团（即PyTPE），其在分子状态下几乎是无荧光的，但作为聚集体的形式则表现出强发射。 因为PyTPE-CRP具有良好的水溶性和在分子状态下通过自由分子内旋转的激子能量消耗, 因此PyTPE-CRP在水性介质中几乎不发荧光。在细菌细胞感染巨噬细胞后，休眠的procaspase-1酶立即被蛋白水解切割激活，从而有效地切割了设计的肽底物。由此得到的PyTPE-CRP残基自发地自组装成聚集体并堆积在含有细菌的吞噬体上，导致PyTPE在巨噬细胞内荧光点亮。此外，该探针还可以作为产生ROS的光敏剂，细菌吞噬体中每单位面积的平均ROS指示剂荧光信号强度比细胞质高约2.7倍，从而诱导细胞内细菌杀灭效率。基于荧光点亮的策略，该探针具有选择和灵敏诊断细菌感染的潜力，并且有望用于细胞内细菌的消除。该成果以题为“AIEgen-Peptide Conjugate: Phototheranostics for Phagosome-Entrapped Bacteria”发表在Angew. Chem. Int. Ed.上。

【图文导读】

Scheme 1.宏观噬菌体介导的细胞内细菌感染的诊断和消除以及PyTPE-CRP的分子结构示意图

Figure 1.探针分子的物理性质表征

A）PyTPE-N3（10μM）和PyTPE-CRP（10μM）在混合溶剂（DMSO/水）中的UV/vis吸收和光致发光（PL）光谱

B）含有ABDA（50μM）和用casp-1处理的PyTPE-CRP的混合物在白光照射（40mW/cm²）下不同时间的吸收光谱

C）与活化的casp-1孵育不同时间的PyTPE-CRP（10μM）的PL光谱

D）用活化的casp-1酶处理PyTPE-CRP后的TEM图像

Figure 2.探针分子的溶液态响应

A）用活的或加热失活的 S. aureus感染后，巨噬细胞内casp-1酶活化的动力学

B）用活细菌或加热失活的细菌感染的巨噬细胞的细胞裂解物处理后，在650nm处PyTPE-CRP的相对荧光强度，没有任何处理作为对照

C）与各种蛋白质孵育后在650nm处监测的PyTPE-CRP的相对荧光强度

D）与用不同浓度的casp-1特异性抑制剂（Ac-YVAD-cmk）预处理的感染性巨噬细胞的细胞裂解物温育后PyTPE-CRP（10μM）的PL光谱

Figure 3.活细胞中细菌感染的延时荧光成像

Figure 4.细胞实验

A）用S.aureus感染Raw 264.7巨噬细胞后60分钟PyTPE-CRP定位的共聚焦图像

B）含有S.aureus的吞噬体的PyTPE-CRP（红色）和细菌DNA的荧光强度谱

C）在PyTPE-CRP存在下细菌感染后使用二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）在巨噬细胞内检测ROS的共聚焦图像

D）含有S.aureus的吞噬体的DCF-DA和细菌DNA的荧光强度谱

E）在不同浓度的PyTPE-CRP存在下，在没有和在40mW/cm²的功率密度下光照射10分钟，RAW264.7巨噬细胞内的S. aureus存活情况，

F）在有无光照射（40mW/cm²,10分钟）的的条件下，PyTPE-CRP对细胞外S. aureus的最小抑制浓度

G）在有无光照射下与不同浓度的探针一起孵育时，Raw 264.7巨噬细胞的存活率

Figure 5.细胞实验

A）万古霉素对不同感染时间的细胞内细菌的MIC

B）细胞内S. aureus对Raw 264.7细胞的细胞毒性

【小结】

在这个工作中，作者报告了一种具有聚集诱导发光（AIE）性质的生物探针，它可以通过动态过程检测细菌感染并杀死巨噬细胞内存活的细菌，特别是通过受感染巨噬细胞中caspase-1活化的特异性分子探针和积累的残留在含有细菌的吞噬体上，导致荧光信号点亮。此外，AIEgen可以作为光敏剂用于产生活性氧（ROS），并且细菌吞噬体中每单位面积的平均ROS指示剂荧光信号强度比细胞质中的高约2.7倍。反过来，这会以高效率和对巨噬细胞的最小细胞毒性诱导细菌杀死。我们设想这种特定的点亮生物探针可以为选择性和灵敏的检测和根除细胞内细菌感染提供新方法。

AIEgen-Peptide Conjugate: Phototheranostics for Phagosome-Entrapped Bacteria

(Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201906099)

课题组介绍：近年来，新加坡国立大学刘斌教授课题组主要研究和探索先进功能材料在生物医学和清洁能源等领域中的应用。在生物医学方面，致力于使用具有良好生物相容性的有机材料以实现对重要生物过程的高效便捷的示踪以及对一些疾病非侵入性的治疗；在清洁能源方面，主要设计合成高效的敏化剂和催化剂，用来将太阳能转化成简便易用的清洁能源。其成果多次发表在 Chem. Soc. Rev, Acc. Chem. Res, Nat. Commun, J. Am. Chem. Soc, Angew. Chem, Adv. Mater, Chem, ACS Nano, Adv. Funct. Mater, Chem. Mater 等国际一流期刊。

通讯作者简介：刘斌，新加坡国立大学教授，化学与生物分子工程学院系主任，新加坡工程院院士，亚太材料科学院院士，英国皇家化学会会士。同时也是ACS Materials Letters, Advanced Materials and Advanced Functional Materials 等多个杂志的副主编及编委。致力于共轭聚合物发光材料、聚集诱导发光材料等在生物医学及能源中的应用研究，其成果多次发表在国际一流期刊，h-因子高达85，连续多年荣获科睿唯安 “高被引科学家” 称号。其多项研究成果实现产业化并创立了LuminiCell公司。个人主页: http://www.chbe.nus.edu.sg/faculty/cheliub

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