新加坡国立大学刘斌教授Angew. Chem. Int. Ed.:通过代谢标记实现细胞内细菌病原体可视化和原位清除

【引言】

巨噬细胞通过识别、摄取和消化侵入性细菌病原体，成为抵御细菌感染的第一道防线。然而，特定细胞内细菌的分泌系统可以使巨噬细胞中病原体持续存活。在宿主巨噬细胞中存活，细胞内细菌可免受其他免疫攻击。在这种情况下，巨噬细胞不仅不能消除细菌，也可能成为细菌繁殖的来源，这可能导致严重的传染病，如结核病。此外，宿主巨噬细胞的屏蔽作用显著阻碍了细胞内细菌的检测和消融。这增加了细胞内细菌的行为研究难度，并降低了抗生素对细胞内细菌相关疾病的治疗效率。

基于对细菌肽聚糖的成像，生物正交标记已成为用于检测细菌的有效策略。肽聚糖是重复单元为N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNAc）的交联网状体。在细菌与代谢前体温育后，细菌细胞壁上表达反应性化学基团（例如叠氮化物，炔烃）。随后引入相应的生物正交基团修饰的荧光团可以通过连接反应有效地标记细菌肽聚糖。由于宿主哺乳动物细胞仅使用一组确定的L-氨基酸进行生物合成，因此引入的D-氨基酸可以特异性地标记细菌的肽聚糖，而不能标记宿主细胞。因此，该策略有望跟踪宿主细胞中的细菌。不幸的是，由于目前的生物正交反应通常需要两步操作，甚至可能需要复合催化剂进行连接反应，到目前为止，细胞内细菌的标记过程需要固定感染性宿主细胞或用宿主细胞外的代谢前体预处理细菌。目前没有可以在活细胞中实现细胞内细菌的实时追踪的报道，更不用说对细菌进行原位消融。

【成果简介】

近日，新加坡国立大学刘斌教授课题组成功开发了一种细菌可代谢的双功能探针TPEPy-D-Ala，它基于D-丙氨酸和一种具有聚集诱导发光特性的光敏剂，用于活体宿主细胞中细胞内细菌的荧光点亮成像和光动力学消融。一旦代谢结合到细菌肽聚糖中，TPEPy-D-Ala的分子内运动被抑制以增强荧光信号，从而提供细胞内细菌的清晰成像。此外，TPEPy-D-Ala可以通过与肽聚糖的共价连接原位有效地消融标记细胞内的细菌，产生20±0.5μg/mL的低细胞内最小抑制浓度（MIC），比通常使用抗生素、万古霉素更加有效。该成果以题为“Visualization and in-situ Ablation of Intracellular Bacterial Pathogen through Metabolic Labeling”发表在Angew. Chem. Int. Ed.上。

【图文导读】

Figure 1.探针分子的光物理性质表征

（a）TPEPy-D-Ala和TPEPy-L-Ala的化学结构和合成途径

（b）TPEPy-D-Ala和TPEPy-丁炔在PBS中的吸收和荧光光谱

（c）TPEPy-D-Ala在不同THF /醚混合物中的荧光光谱

（d）在PBS中或在与BSA（0.01mg/mL），磷脂（0.01mg/mL），巨噬细胞裂解物和MRSA孵育后在650nm处TPEPy-D-Ala的相对荧光强度;

（e）在不同的白光照射（60mW/cm²）时间下ABDA和TPEPy-D-Ala混合物的吸收光谱

Figure 2.TPEPy-D-Ala在肽聚糖生物合成中的生物成像

（a）探针分子的成像机理示意图

（b）探针分子对MRSA的荧光成像

（c）探针分子对大肠杆菌的荧光成像

Figure 3.MRSA感染的RAW 264.7细胞的成像

用TPEPy-D-Ala（a）或TPEPy-L-Ala与Hoechst 33342（b）处理的MRSA感染的RAW 264.7细胞的成像

Figure 4.光动力学治疗

（a）在光照射下用不同浓度的TPEPy-D-Ala处理细胞内MRSA的CFU

（b）在黑暗条件下或光照射下用不同浓度的TPEPy-D-Ala处理的RAW 264.7细胞的细胞活力

【小结】

在这个工作中，作者开发了一种实时细胞内细菌标记的点亮探针和原位光动力学消融。一旦代谢结合到肽聚糖中，探针可以清楚地追踪隐藏在活巨噬细胞中的细胞内细菌。在定位这些细胞内细菌后，探针可以在光照射下有效地消融它们。这个工作首次实现了活细胞中细胞内细菌的可视化和消除。作者所开发的策略将有益于细胞内细菌相关疾病的实时检测和治疗。

Visualization and in-situ Ablation of Intracellular Bacterial Pathogen through Metabolic Labeling

(Angew. Chem. Int. Ed., 2019, DOI: 10.1002/anie.201910187)

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