浙大刘建钊和唐本忠课题组Chem. Commun.: 通过荧光和质谱联用的表征方法对细胞内RNA的合成与降解进行可视化和定量分析

【引言】

RNA在调节基因表达中起着至关重要的作用，包括传递遗传信息、感知或传递对细胞信号的反应，以及催化生物反应和表观遗传修饰。细胞内RNA水平由RNA的合成和衰变两方面所决定，并受到细胞内控制基因表达模式的严格控制。对细胞内RNA代谢动力学的研究可以为细胞内RNA的转录和相关疾病的起因提供新的认知和理解。

为了原位研究细胞内的动态过程，如RNA的生物合成与降解，科研工作者开发了代谢标记法。这种利用细胞代谢对RNA进行标记的方法通常使用RNA核苷类似物，比如5-溴尿苷（5-BrU）和5-乙炔基尿苷（5-EU），作为标记试剂，并能够随时间跟踪新转录的RNA，而不会干扰细胞的完整性。与经典的核苷相比，这些类似物在结构上略有变化，以确保他们可以通过代谢进入到新合成的RNA中，而不影响碱基配对。一般而言，这些类似物含有或能够用放射性化合物、抗体或荧光化合物进行后期修饰。对于放射性跟踪而言，这种方法需要使用危险且价格昂贵的放射性核苷；除此之外，放射自显影的过程很缓慢，暴露时间长达几周，并由于信噪比较低而导致分辨率较差。在5-Br-抗体结合的方法中，这个方法涉及繁琐的细胞培育和洗涤步骤，组织染色还会受到抗体扩散等问题的干扰。与上述方法相比，基于小分子的荧光探测凭借其低成本、响应快、易于检测、灵敏度高和危害性较低等优点在众多方法中脱颖而出。例如，基于5-EU代谢标记和使用叠氮化物-炔烃点击化学的荧光团生物正交修饰的方法，已经用于探索细胞RNA转录，然而，该方法所使用的荧光生色团具有较严重的光漂白问题，导致其产生的荧光信号在激光扫描下很不稳定，造成较大的量化误差。

迄今为止，科研工作者已经开发出了很多荧光探针，并成功应用于RNA标记和传感中，其中一些荧光探针已经商业化。然而，这类探针大多数都表现出ACQ的性质，即分子呈单分子状态时发光较强，而当分子在聚集态时发光变弱。因此这类分子只能在低浓度的非聚集态使用，又导致了抗光漂白能力较差的问题，限制了其在定量分析测试中的应用。香港科技大学的唐本忠院士课题组在2001年发现了一种与传统ACQ发光现象截然不同的反应：聚集诱导发光。当分子以单分子状态溶解在溶液中时，分子几乎不发光；当分子处于聚集状态时，发光明显增强。这是由于当分子处于单分子状态下时，激发态的能量通过分子内运动以非辐射跃迁的方式耗散掉。当分子发生聚集以后，分子内旋转和振动受限，激发态的能量只能通过激发态到基态的辐射跃迁完成，从而观察到发光增强。到目前为止，AIE荧光探针已经被广泛开发出来，并成功应用于体外和体内生物检测和成像中，包括生物分子特异性检测、细胞成像和诊疗一体化等。与传统ACQ染料相比，AIE染料具有较大的斯托克斯位移、更强的抗光漂白能力和更强的发射强度等优点。因此，认为AIE探针可以用于RNA合成与降解的定量研究中。

【成果简介】

近日，浙江大学刘建钊研究员课题组和唐本忠院士课题组合作，合成了炔烃修饰的腺苷，即N⁶-炔丙基腺苷（p⁶A），来标记细胞内新转录的RNA。选择p⁶A作为RNA标记物的原因主要有两个：一个是p⁶A的化学结构与腺苷非常相似，不影响碱基配对，其炔丙基修饰为荧光标记的后续正交点击修饰提供了化学基础；另一方面，腺苷衍生物相对于嘧啶衍生物而言，具有更加优异的检测灵敏度，可以在质谱中进行RNA的定量检测。我们合成了具有AIE性质的荧光探针，SO₃-TPE-N₃。探针具有叠氮基团，可以与标记物p⁶A上的三键进行点击反应，使新转录的RNA带上荧光标记。除此之外，SO₃-TPE-N₃的荧光为黄色，可以避免细胞自发荧光的干扰。当探针分子与RNA共价连接时，其分子内运动受限导致荧光强度增加；细胞合成的RNA越多，细胞内的荧光强度就越强。通过结合荧光光谱数据和超高效液相色谱结合三重四级杆串联质谱（UHPLC-QQQ-MS/MS）表征分析，我们发现荧光信号在特定时间内与细胞内p⁶A含量呈线性关系，使我们对RNA的检测成为一种定量的方法。这种工作将荧光成像与质谱定量相结合，为生物学研究提供了一种简单而强大的工具，可用于细胞内RNA生物合成与降解的可视化与定量分析。该成果以题为“Visualization and quantification of cellular RNA production and degradation using a combined fluorescence and mass spectrometry characterization assay”发表在Chem. Commun.上。

【图文导读】

Figure 1.在p6A代谢标记的RNA成像中，具有AIE活性的SO3-TPE-N3与商业染料Alexa488-N3的光物理性能的比较

（A,B）浓度为10 μM的Alexa488-N₃和SO₃-TPE-N₃的紫外吸收光谱和荧光发射光谱

（C）分别用SO₃-TPE-N₃和Alexa488-N₃染色后的HeLa细胞，在不同时间间隔激光扫描后，用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像的图像。激发波长分别为405 nm和488 nm; 比例尺为20 μm；探针浓度为10 μM

（D）在共聚焦激光扫描显微镜下记录的细胞图像的PL强度与扫描时间的关系

Figure 2.在不同实验处理条件下，荧光探针标记HeLa细胞内RNA的CLSM图像

（A-C）将细胞与p⁶A（1 mM）一起培育，然后利用炔-叠氮化物点击化学用SO₃-TPE-N₃对细胞染色

（D-F）将细胞用p⁶A（1 mM）和转录抑制剂放线菌素D（5 µg/ mL）孵育6小时，然后进行与A-C相同的荧光染色方法

（G-I）将细胞与hydrourea（10 mM）一起温育6小时，并应用相同的染色方法。蓝色通道：激发波长：405 nm; 收集波长：420-440 nm; 黄色通道：激发波长：405 nm; 采集波长：520-560 nm。比例尺为20 µm

Figure 3.使用p⁶A代谢标记和SO₃-TPE-N₃荧光成像策略对HeLa细胞中RNA合成过程的研究

（A-L）将HeLa细胞与p⁶A（1 mM）一起温育0, 2, 4和6小时，然后利用叠氮化物-炔烃点击化学的方法用SO₃-TPE-N₃对p⁶A标记的细胞进行染色。蓝色通道：激发波长：405 nm; 采集波长：420-440 nm; 黄色通道：激发波长：405 nm; 采集波长：520-560 nm。比例尺为20 µm

（M）全细胞荧光强度与不同p⁶A孵育时间之间的函数关系

（N）使用UPHLC-QQQ-MS/MS测定的HeLa细胞中在p⁶A存在下对总RNA p⁶A摄入含量与不同孵育时间的定量分析

（O）p⁶A与细胞培育不同时间后的UPHLC-QQQ-MS/MS测定，检测通道对于具有质量转变（306至174）的p⁶A是特异性的

（P）全细胞荧光强度与p⁶A/A的线性相关性

Figure 4.使用p⁶A代谢标记和SO₃-TPE-N₃荧光成像策略对HeLa细胞中RNA降解过程的研究

（A-L）将用p⁶A（1 mM）预处理6小时的细胞与RNA合成抑制剂一起孵育0, 2, 4和6小时，然后利用叠氮化物-炔烃点击化学的方法用SO₃-TPE-N₃对p⁶A标记的细胞进行染色。蓝色通道：激发波长：405 nm; 采集波长：420-440 nm; 黄色通道：激发波长：405 nm; 采集波长：520-560 nm。比例尺为20 µm

（M）全细胞荧光强度与不同RNA合成抑制剂孵育时间之间的函数关系

（N）使用UPHLC-QQQ-MS/MS测定的HeLa细胞中在p⁶A存在下对总RNA p⁶A摄入含量与不同RNA合成抑制剂孵育时间的定量分析

（O）p⁶A与RNA合成抑制剂培育不同时间后的UPHLC-QQQ-MS/MS测定，检测通道对于具有质量转变（306至174）的p⁶A是特异性的

（P）全细胞荧光强度与p⁶A/A的线性相关性

【小结】

在这个工作中，我们报导了一种荧光成像与质谱检测结合的方法用于实现细胞内RNA生物合成与降解的可视化和定量分析。这种方法为生物学研究RNA代谢提供了一种简单、低成本的方法，可以及时研究原位RNA的动态。标记物p⁶A可以通过代谢进入细胞RNA中，并可以通过质谱定量检测其含量。除此之外，p⁶A的碳碳三键，可以与荧光探针中的叠氮基团进行点击反应，实现细胞内新合成的RNA的荧光标记。与易于光漂白的商业ACQ探针相比，我们新合成的AIE荧光探针SO₃-TPE-N₃，在生物水环境中具有较高的亮度、优异的光稳定性和较大的斯托克斯位移。通过高灵敏度的质谱定量验证，我们发现在细胞RNA生物合成和降解过程中的细胞荧光信号与细胞内p⁶A标记的RNA含量呈较好的线性关系。因此，我们认为这种荧光成像与质谱结合的方法可以实现细胞内RNA代谢的可视化和量化。

Visualization and quantification of cellular RNA production and degradation using a combined fluorescence and mass spectrometry characterization assay

(Chem. Commun., 2019, DOI: 10.1039/c9cc03923f)

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