看拉曼光谱（Raman spectra）在顶刊中有哪些出神入化的应用

拉曼光谱（Raman spectra）是一种散射光谱，是1928年印度物理学家C.V.Raman发现的。拉曼效应来源于分子振动(和点阵振动)与转动，从拉曼光谱中可以得到分子振动能级(点阵振动能级)与转动能级结构的信息，在有机化学方面常用作结构鉴定和分子相互作用分析，与红外光谱互为补充，鉴别特殊的结构特征或特征基团。

拉曼光谱以其信息丰富、制样简单、水的干扰小等独特优点，在化学、材料、物理、高分子、生物、医药、地质等领域有着广泛的应用。拉曼光谱中包含大量信息：拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状，半高宽等都是是鉴定化学键、官能团、结晶度、应变的重要依据。本文主要介绍拉曼光谱在生物、医学、材料物理、纳米光谱学等方面的应用，并从science中选取了几篇具有代表性的工作进行介绍。

一、纳米粒子的拉曼指纹光谱用于DNA和RNA检测[1]

利用拉曼光谱作为窄带指纹光谱的概念可以设计大量具有拉曼活性的探针，该方法灵敏度高、选择性高，且增加了多路复用和比率功能。用寡核苷酸和有拉曼活性的染料标记的金纳米颗粒探针可对寡核苷酸靶标进行多重检测。被染料标记的颗粒被靶分子和微阵列形式的底层芯片捕获，银涂层充当染料标记颗粒的表面增强拉曼散射促进剂，金纳米颗粒用于促进银涂层的形成。本文具体使用六个具有拉曼标记的纳米颗粒探针分析了六个不同的DNA靶标，以及具有单核苷酸多态性的两个RNA靶标。

图1.

a, b银涂层表面增强前后的扫描示意图，c某个Ag spot处的拉曼光谱，d. 对应b图各点在1192cm^-1处的拉曼强度分布

在银增强之前，纳米颗粒探针肉眼不可见，检测不到拉曼散射信号，银增强之后，Ag纳米颗粒可以在染料标记的纳米颗粒探针周围生长，增强拉曼散射，而且其他市售染料也具有不同且可测量的SERS信号能够用于多重检测。通过DNA合成将六种不同的染料掺入寡核苷酸中，制备出了六种类型的拉曼标记和寡核苷酸修饰的Au纳米颗粒探针，检测甲型肝炎病毒（HVA），病毒表面抗原基因（HVB），人类免疫缺陷病毒（HIV），埃博拉病毒（EV），天花病毒（VV）和炭疽芽孢杆菌（BA）。

图2.

a六种染料标记的纳米颗粒探针在银涂层表面增强后的拉曼光谱，b 具有相应靶分析的六种DNA

因为此方法中可用的拉曼染料的数量远远大于可用和可辨别的荧光染料的数量，与传统的基于荧光的检测方法相比，这种指纹识别方法更灵活，多路复用能力更强。而且该方法结合了基于Au纳米颗粒的检测先前的所有优点，比基于类似分子荧光法高几个数量级的高灵敏度和高选择性。纳米粒子在生物诊断研究的标记技术中越来越重要。

二、受激拉曼散射显微镜实现高灵敏度的无标记生物医学成像[2]

无标记化学对比在生物医学成像中非常重要。普通的拉曼显微镜虽然能提供化学键的特定振动特征，但灵敏度低。而基于受激拉曼散射（SRS）的三维多光子振动成像技术通过施加高频（兆赫）相敏检测，能够实现极高的灵敏度，图像无背景且化学对比度易于解释。可在生物医学中应用，例如区分活细胞中ω-3脂肪酸和饱和脂质的分布，基于内在脂质对比的脑和皮肤组织成像，监测通过表皮的药物递送等。

图1. SRS原理与设计，及其与普通拉曼成像的相关对比。

图2.

a. DHA, EPA, AA,OA的普通拉曼光谱，b. 脂滴（LD，红线）和细胞核内区域（蓝线）的SRL光谱，c. 2920cm^-1处细胞的SRL图像，d. 3015cm^-1处相同细胞的SRL图像。

图3. 小鼠组织SRL成像

小鼠脑胼胝体神经元髓鞘、脑组织、耳朵、皮肤等处-CH₂ 的SRL成像十分清晰，且组织中的自发荧光不会干扰SRS，与CARS成像比较，SRL成像没有非共振背景，更加直观利于解析。

三、表面增强共振拉曼散射“纳米星”用于高精度癌症成像[3]

无法可视化癌症的扩散程度是肿瘤学领域的重大挑战，因为癌症能扩散渗透到周围的组织，大多数癌症的扩散边界不能被清晰地划分。此外，癌症可能是多灶性的并且存在微观卫星病变，容易持续存在，局部复发和转移扩散，现有的成像技术不可能将其可视化。但是临床和手术需要一种揭示肿瘤真实扩散程度的成像方法，Stefan等人使用新一代表面增强共振拉曼散射（SERRS）纳米粒子（称为SERRS纳米星）显示肿瘤边缘，做到局部区域肿瘤扩散的精确可视化。SERRS纳米星具有星形金核，在近红外光谱中有拉曼共振，且不引入杂质。在基因修饰的小鼠模型中，以及一种人肉瘤异种移植模型中，SERRS纳米星能够准确检测到胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肉瘤等肉眼可见的恶性病变以及其他显微疾病，而无需靶向部分。此外，SERRS纳米星的灵敏度（1.5 fM检测限）允许对胰腺和前列腺肿瘤的癌前病变进行成像。高灵敏度和广泛的适用性，结合其惰性金-二氧化硅组合物，使SERRS纳米星成为一种有前景的成像剂，用于更精确的癌症成像和癌症切除。

图1. 小鼠模型中的乳腺癌成像

AB图是右上胸腺和右下胸腺中形成两个相邻的肿瘤，C图是沿着白色虚线切除肿瘤后切除床的光学图像和拉曼成像。未切除肿瘤时，抗PEG IHC染色显示肿瘤中存在SERRS纳米星，从拉曼成像中也能清晰直观的看到残留的肿瘤部分，与切除后PyMT染色显示的残留肿瘤位置形状等高度吻合。

SERRS纳米星是一类新的分子成像剂，能够描绘原发肿瘤，尺寸小至100微米的局部肿瘤沉积以及癌前病变。而且文中对相关动物模型的研究发现，无论在癌症哪个阶段这都是可行的。所以有望将拉曼成像用于肿瘤学的临床应用：改进图像引导肿瘤切除，使用拉曼内窥镜进行早期癌症检测，更深层组织的非侵入性成像。

四、拉曼扫描电子显微镜（RISE）成像[4]

随着各类研究的深入，对表征技术的要求也越来越多样化，不同的表征技术相互结合相互补充，做到1+1>2的现象也越来越多。有的仪器公司已经将拉曼成像和扫描电子显微镜结合，推出了拉曼扫描电子显微镜。这是一种无标记的非破坏性技术，可以用于识别样品的分子组成并成像。SEM使样品的表面结构可视化，其相关的能量色散X射线光谱学能识别元素成分，但难以表征物质的化学结构，而拉曼可以对分子结构进行分析，将两种技术集成到一起能够大大加快实验进程。拉曼扫描电子显微镜是将拉曼显微镜所需的物镜和样品台放置在SEM的真空室内，用极其精确的扫描软件驱动机制在拉曼和SEM测量位置之间转移样品。可用于纳米技术，生命科学，地球科学，制药和材料研究等领域。

图1. 拉曼扫描电子显微镜

常见的还有拉曼与AFM，气相、液相色谱联用，以及现在使用非常多的电化学原位拉曼技术，有兴趣的同学可以深入了解一下。

五、拉曼表征单壁碳纳米管功能化的电子结构控制[5]

单壁碳纳米管制备的一大挑战就是操控其电子结构，已知的制备方法能够制备半导体，半金属和金属类型的碳纳米管。带隙荧光和拉曼光谱的光谱识别，能够极大地提高对分散在溶液相中的纳米管的不同电子结构的监测能力，明确其半导体、半金属和金属特性。

图1. 功能化碳纳米管在532 nm下的拉曼光谱

官能化增加了单壁碳纳米管在拉曼光谱中1330cm^-1处的峰强度，对应于sp³ C_sp² C 形成时sp² C向sp³ C的转化。D峰是破坏石墨烯平面基本对称性的缺陷通过声子发射共振增强的电子散射。分析功能化程度不同的单壁碳纳米管发现，无序模式D峰强度随着功能化的增加而急剧增加，然后随着系统失去电子共振而减小。切向模式（TM）的峰强度随着功能化的增加而降低。

图2. 四个金属性质碳纳米管（黑色）和半导体性质的碳纳米管（红色）的低波数拉曼光谱

每1000个碳连接5.6个基团后，功能化使得碳纳米管的拉曼光谱发生显著改变，在比率为22.4之后，光谱信息能够明确区分开金属性和半导体性质的碳纳米管。拉曼光谱可以成功表征功能化单壁碳纳米管的电子结构。

小结

表面增强拉曼和共焦显微拉曼光谱等新拉曼技术，解决了拉曼光谱在早期应用中存在的很多问题，如荧光干扰、固有灵敏度低等，而且近年来先进激光器的发展和其他光谱技术的不断革新，与气相、液相色谱，SEM/AFM等仪器的联用拓宽了拉曼光谱的应用范围，研究分子微观动力学，蛋白质构相，超导体等等。

[1] Y.C. Cao, R. Jin, C.A. Mirkin, Nanoparticles with Raman Spectroscopic Fingerprints for DNA and RNA Detection, Science, 297 (2002) 1536-1540.

[2] C.W. Freudiger, W. Min, B.G. Saar, S. Lu, G.R. Holtom, C. He, J.C. Tsai, J.X. Kang, X.S. Xie, Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy, Science, 322 (2008) 1857-1861.

[3] S. Harmsen, R. Huang, M.A. Wall, H. Karabeber, J.M. Samii, M. Spaliviero, J.R. White, S. Monette, R. O’Connor, K.L. Pitter, S.A. Sastra, M. Saborowski, E.C. Holland, S. Singer, K.P. Olive, S.W. Lowe, R.G. Blasberg, M.F. Kircher, Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging, Science Translational Medicine, 7 (2015) 271ra277-271ra277.

[4] New Products, Science, 353 (2016) 509-509.

[5] M.S. Strano, C.A. Dyke, M.L. Usrey, P.W. Barone, M.J. Allen, H. Shan, C. Kittrell, R.H. Hauge, J.M. Tour, R.E. Smalley, Electronic Structure Control of Single-Walled Carbon Nanotube Functionalization, Science, 301 (2003) 1519-1522

往期回顾：

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