中国农业大学罗云波&许文涛团队ChemCommun内封面文章：基于核酸纳米阶梯和氧化石墨烯的Hg2+非酶恒温快速检测技术

【引言】

Hg²⁺是一种全球性重金属污染物，实现Hg²⁺的快速、灵敏检测对环境保护和人类健康具有重要意义。同其他金属离子一样，Hg²⁺的检测方法也经历了由仪器分析到传感器检测的过程。传统的仪器分析法例如原子吸收/发射光谱法，原子荧光光谱法和质谱法等在灵敏度和准确性方面具有明显的优势，但昂贵的设备和繁琐的样品处理过程使其难以广泛应用。

传感器检测法可弥补仪器分析法的不足，具有简单、快速、不需要大型仪器等优势。近年来，基于功能核酸和纳米材料的生物传感器被越来越多的应用到Hg²⁺等重金属离子的快速检测上。这类传感器的基本原理是信号转导，重金属离子的化学信号作为信号输入，在核酸、小分子、电化学材料、金属纳米粒子和蛋白酶等的辅助下可以被转化为其他信号被输出，例如光学信号和电化学信号等。但是大多数基于分子生物学的方法仍具有一定的局限性，因为会涉及分子修饰或一些需要依赖蛋白酶的过程。因此，仍需要更简单、更直接的传感器方法以实现Hg²⁺的快速检测。

【 成果简介】

近日，中国农业大学罗云波教授和许文涛副教授（共同通讯作者）团队在Chemical Communications杂志在线发表了一篇题为“Mercury nanoladders: a new method for DNA amplification, signal identification and their application in the detection of Hg(II) ions”的文章，建立了一种基于Hg²⁺纳米阶梯和氧化石墨烯（GO）纳米材料的Hg²⁺快速检测的方法。Hg²⁺纳米阶梯是建立在DNA超夹心结构上的一种新的核酸结构。本研究依靠T-Hg-T结构对超夹心DNA进行了改造，形成一种Hg²⁺拉力诱导的新型Hg²⁺纳米阶梯结构。这种新型Hg²⁺依赖型组装元件，辅以荧光基团修饰辅助，除信号放大的作用外，可以作为Hg²⁺的靶标分子识别和信号转化元件。

研究表明，GO的大π共轭结构和DNA中的碱基具有很强的π-π相互作用，因而单链DNA可以高效吸附在GO的表面，但对于双链DNA，由于具有芳香结构的碱基处于DNA双螺旋结构的内侧，外侧带负电性的磷酸骨架对其有屏蔽作用，使其与同样带负电性的GO彼此发生静电排斥，所以双链DNA不能被稳定的吸附在GO表面。利用GO对单双链吸附能力的差异性质，结合荧光素分子与GO之间的荧光共振能量转移，建立了“turn-on”型荧光传感器。在无Hg²⁺存在的情况下，没有Hg²⁺的诱导，不能形成T-Hg-T结构，纳米阶梯不能形成，GO将淬灭标记有荧光分子的单链引物的荧光信号。在Hg²⁺存在的情况下，Hg²⁺可以成功诱导纳米阶梯的形成，GO不能淬灭生成的纳米阶梯上的荧光分子的荧光信号，实现Hg²⁺的快速高灵敏检测。与以前报道的技术相比，Hg²⁺纳米阶梯-GO传感器能够在40 min之内实现Hg²⁺的定量检测。

 【图文导读】

 图1. Hg²⁺纳米及GO的表征 

（a）用圆二色谱（CD）表征有无Hg²⁺时Hg²⁺ 纳米阶梯二级结构的变化，其中蓝色的曲线代表没有Hg²⁺存在；红色的曲线代表有Hg²⁺存在；绿色的曲线代表Tris-HCl Buffer。

（b）GO在原子力显微镜（AFM）下的表征，标尺500nm。

 图2. Hg²⁺纳米阶梯缓冲液优化

（a）缓冲液种类优化；

（b）Tris-HCl Buffer 中Tris含量优化；

（c）Tris-HCl Buffer 中NaCl含量优化；

（d）Tris-HCl Buffer 中Mg²⁺含量优化。

图3. Hg²⁺纳米阶梯孵育时间及引物P1浓度优化

（a-d）GO对不同孵育时间、不同浓度引物P1搭载的纳米阶梯10 nM (a) 20 nM (b) 50 nM (c)和100 nM (d)的荧光淬灭效率曲线图，其中蓝色的曲线代表P1+ P2；红色的曲线代表P1+ P2 +Hg²⁺,；绿色的曲线代表P1 +T1。

图4. Hg²⁺的定量与特异性分析

（a）Hg²⁺纳米阶梯-GO传感器检测区间及标准曲线；

（b）Hg²⁺纳米阶梯-GO传感器特异性分析。

【小结】

（1） 本研究通过引入功能核酸材料Hg²⁺纳米阶梯，结合纳米材料氧化石墨烯（GO），建立了能够在无酶、恒温条件下实现Hg²⁺定量检测的生物传感器。

（2） 通过对Hg²⁺纳米阶梯序列、缓冲环境、引物浓度等因素的调整和优化，论证了Hg²⁺纳米阶梯结构相较于传统双链结构在GO体系中具有更高的灵敏度，论证了搭载Hg²⁺纳米阶梯的必要性。

（3） 该生物传感器实现了Hg²⁺的快速检测，检测时长40 min。定量检测限为1.5 nM，检测区间为0~20 nM，具有良好的特异性，且能够用于实际样品的检测。

文献链接：Mercury nanoladders: a new method for DNA amplification, signal identification and their application in the detection of Hg (II) ions (Chem. Commun., 2018, 54, 8036, DOI: 10.1039/c8cc03851a)

【通讯作者及团队简介】

罗云波教授：国际食品科学院院士，国务院食品安全委员会专家委员会委员，国家农业转基因生物安全委员会委员，农业部质量安全专家组委员，中国园艺学会园艺产品采后分会理事长，中国农学会农产品贮藏加工分会副理事长，农产品贮运保鲜产业技术创新战略联盟理事长，中国食品学会理事，北京食品协会副主席，全国高校食品学院院长联谊会会长。现任农业部农产品质量监督检测中心（北京）副主任，农业部转基因生物食用安全监督检验检测中心（北京）工作常务副主任。

长期从事食品安全控制理论与工程技术研究，在食品和食用农产品安全检测新技术与装备研究、农产品采后质量保持与安全控制、食品安全管理与风险评估等领域取得了丰硕成果。发表SCI论文140篇，其中IF 5.0以上的20篇；获得发明专利15项；国家科技进步二等奖 1 项、省部级科技进步二等奖4项；作为核心专家参与国家食品安全监管系统工程、农产品质量安全监管工程、农产品风险评估工程的顶层设计；对我国食品及农产品安全监管工程的科技创新做出了突出贡献。

许文涛副教授：现任农业部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室副主任，农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（北京）副主任，农业部农产品质量监督检测中心（北京）副主任。获得国家级教学成果奖1项、省部级二等奖4项、三等奖2项。荣获教育部新世纪优秀人才、北京市科技新星等称号。主持和参与国家级、省部级课题30余项，发表SCI论文100余篇，荣获授权国家专利19项，出版英文专著3本。

近5年，针对不同食品安全风险因子检测方法各异现象，将功能核酸修饰在金纳米材料表面，利用功能核酸将各种风险因子信号统一转化为核酸信号，提出功能核酸统一化快检思路，建立功能核酸数据库，搭建功能核酸和金纳米材料为基础的食品安全快检技术体系，发表相关论文56篇，其中SCI收录论文38篇（代表性的有：Biosensors and Bioelectronics, 2018,117: 75-83； ACS applied materials & interfaces, 2017, 9(46): 40671-40680；Chemical Communications, 2018，54, 8036-8039；Analytical chemistry, 2018, 90(9): 5586-5593；Sensors and Actuators B: Chemical, 2018, 260: 870-876.）。

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