中科院上硅所施剑林Adv. Mat.：Fe-Au纳米粒子耦合体系用于循环肿瘤DNA的高灵敏度检测

【引言】                                                                                              

实现癌症的早期诊断并及时治疗是提高癌症治愈率最有效的策略。研究人员在癌症患者的外周血中检测到与肿瘤细胞一致的突变基因，即循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。ctDNA 是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的基因碎片，是癌症散落在血液中的“信息密码”。 ctDNA浓度的变化要远早于影像学等手段检测到肿瘤组织的变化。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，对ctDNA的精准分析能实时监测病人体内肿瘤负荷的动态信息，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果，优势显著。最为重要的是，对ctDNA的监测只需要抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，可实现多次实时高频监测。ctDNA 检测是一种新型无创的“液体活检”方式，有望弥补现有临床诊断方法的不足，提供从肿瘤细胞水平到分子水平的分析平台，为个体化治疗提供参考。基于ctDNA检测的无创“液体活检”技术有望取代侵入性的“组织活检”用于肿瘤治疗进展的监测，该领域的基础研究具有非常重要的科学意义和临床价值。然而现有的基于聚合酶链式反应（PCR）和基因测序（NGS）的ctDNA检测技术预处理步骤繁琐，假阳性几率高, 特异性和灵敏度受限，现阶段无法作为常规的诊断方法应用于临床医学中。

【成果简介】

近日，中国科学院上海硅酸盐研究所的施剑林教授（通讯作者）团队基于当前ctDNA 检测面临的技术难点，提出一种基于两种功能性纳米粒子特异性耦合、结合磁性分离富集，实现循环肿瘤DNA 高灵敏度精准检测的新方法。通过两种纳米颗粒表面修饰的捕捉DNA与目标ctDNA互补配对，保证了识别的高度专一性；制备了高磁导率、快速磁响应的非晶铁@SiO₂纳米颗粒对ctDNA进行高效磁性分离与富集，避免了繁琐的PCR扩增与基因测序过程，克服了ctDNA因低浓度无法检测的难题，实现了ctDNA的快速、特异、高灵敏度检测，有望推动基于ctDNA检测的液体活检技术在肿瘤诊疗中的应用。相关成果以题为“Fe-Au Nanoparticle-Coupling for Ultrasensitive Detections of Circulating Tumor DNA”发表在Adv. Mat.杂志上，论文的共同第一作者为胡萍、张盛箭。

 【图文导读】

图1.检测突变KRAS基因的纳米颗粒耦合策略

以突变的KRAS 基因作为检测的目标ctDNA。如图所示，首先将突变KRAS 基因的互补碱基序列分为两段引物DNA₁和DNA₂ 制备， 然后在非晶Fe@SiO₂ 磁性纳米颗粒表面修饰DNA₁， Au 颗粒表面修饰DNA₂; 当突变的KRAS 基因存在时, 纳米颗粒表面修饰的引物链（DNA₁和DNA₂）与突变的KRAS 基因互补配对，非晶Fe@SiO₂ 纳米颗粒和Au 纳米颗粒通过突变的KRAS 基因偶联在一起。磁性分离出的非晶Fe@SiO₂ 表面有Au 纳米颗粒说明检测体系中存在突变的KRAS 基因; 无目标待测基因存在时，磁性分离得到的非晶Fe@SiO₂ 表面无Au 纳米颗粒。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测磁性分离产物中Au 元素的含量，根据标准溶液中Au 含量与突变的KRAS 基因含量的线性关系，实现对ctDNA 的准确定量。

图2.纳米颗粒探针的表征

a）AFe纳米粒子的低倍TEM照片（插图为AFe的选区电子衍射）；

b）AFe纳米粒子的高倍TEM照片；

c）EDS能谱分析揭示了纳米颗粒中的主要元素;

d）AFe@SiO₂ 纳米颗粒的TEM照片；

e）AFe@SiO₂纳米颗粒在磁铁吸引下聚集的照片；

f）利用ICP-MS检测水溶液中AFe@SiO₂纳米颗粒的磁分离效率，在2.5分钟内磁性分离率为75.8％，并在15分钟内达到100％（即完全分离）；

g-h） Au纳米颗粒的低倍TEM照片和高倍TEM照片；

i） Au纳米颗粒表面修饰捕捉DNA₂前后的UV-Vis吸收光谱变化（AuNPs: black line，Au-DNA₂ NPs: red line ）

图3.纳米探针对突变KRAS基因检测的灵敏度和选择性评估

a-d） 不同浓度a）0.3ng mL^-1, b) 0.12 ng mL^-1, c) 0.06 ng mL^-1, d) 0 ng mL^-1 的突变KRAS基因（134A序列）存在时AFS-D和A-D纳米颗粒耦合体系的TEM照片；

e）Au元素的浓度（pg mL^-1）与系统中134A序列浓度之间的线性关系证明该检测方法具有较高的灵敏度；

f）AFS-D和A-D纳米探针对于检测突变KRAS基因的七种等位基因的有效性；

g）在NRAS等其他癌基因存在时，AFS-D和A-D纳米探针对目标突变KRAS基因的检测没有受到影响，证明该检测方法具有很好的选择性 。

图4.纳米颗粒耦合体系针对实际血液样本的具体检测方案

（1）在95^oC下ctDNA双链解链成单链DNA；（2） 加入“磁性纳米钳”颗粒，使其与突变型KRAS序列的互补链(C-MT-KRAS) 和野生型KRAS序列的互补链(C-WT-KRAS) 发生碱基互补配对，从而防止目标待测的突变KRAS序列(MT-KRAS)与互补链再杂交；（3）检测系统降低到0^oC；（4）加入表面修饰“掩蔽DNA”的磁性纳米粒子，使其与野生型KRAS序列(WT-KRAS)互补配对，完全掩蔽野生型KRAS序列对检测的干扰；（5）通过磁分离完全去除检测体系中的C-WT-KRAS、C-MT-KRAS和WT-KRAS；（6）加入AFe@SiO₂-DNA₁和Au-DNA₂纳米探针进行突变KRAS基因的高灵敏度、无干扰检测。

图5.“磁性纳米钳”与“磁性掩蔽剂”对于高灵敏检测的重要性

a）“磁性纳米钳”与“磁性掩蔽剂”在检测中发挥重要的作用：添加“磁性纳米钳”（A）可以避免目标基因漏检, “磁性掩蔽剂”（B）可以降低检测的假阳性概率；b) 对于U87等六种恶性肿瘤细胞DNA中突变KRAS序列的检测结果。

表1.临床肺腺癌患者血液样本中突变KRAS基因的检测结果

图6.纳米粒子耦合体系对于荷瘤小鼠血液中突变KRAS基因的动态跟踪检测

a）对于未实施治疗的荷瘤裸鼠血液中突变KRAS基因的动态检测结果：荷瘤裸鼠血液中突变KRAS基因的浓度随着肿瘤负荷的增加而持续增加；

b）对于化疗后荷瘤裸鼠血液中突变KRAS基因浓度的动态检测结果：化疗后短时间内突变KRAS基因浓度下降，7天后突变KRAS基因浓度又开始回升；

c）对于癌症早期实施手术切除肿瘤后，血液中突变KRAS基因浓度迅速下降，手术后42天内血液中未检测到突变KRAS基因；

d）对于癌症晚期实施手术切除肿瘤后，血液中突变KRAS基因浓度迅速下降，手术后21天检测到突变KRAS基因浓度又开始回升。

【小结】

本工作合成了具有高效磁响应性能、生物相容性好的AFe@SiO₂ 纳米复合材料，构建了基于两种功能型纳米探针的耦合体系用于循环肿瘤DNA的特异、高灵敏度识别，克服了现有的ctDNA 检测技术面临的浓度低、背景干扰严重两大难题，发展了一种全新的基于纳米生物技术的ctDNA检测策略。最重要的是该方法能成功检测出Ⅰ期肺腺癌患者血清样本中低至0.27 pg mL^-1的突变KRAS基因，显示出很好的临床应用前景。AFe@SiO₂ 与Au 纳米耦合体系将纳米材料独特的物理和化学性能应用于基于ctDNA 检测的液体活检领域，可能为临床肿瘤的早期诊断、预后判断及跟踪随访提供一系列方便、快捷、特异、无创的检测手段。

文献链接：Fe–Au Nanoparticle-Coupling for Ultrasensitive Detections of Circulating Tumor DNA（Adv. Mat.，2018，DOI: 10.1002/adma.201801690）

 【通讯作者及团队简介】

施剑林教授，曾从事先进陶瓷材料制备科学、烧结理论、结构陶瓷高温可靠性等研究。当前的研究领域包括无机纳米材料、介孔基纳米复合材料合成与催化、抗癌药物靶向输运、肿瘤等重大疾病的早期诊断与治疗等研究。先后承担了国家重大基础研究（“973”）计划(首席科学家)，国家高技术（“863”）项目、国家自然科学基金重点项目、发改委高技术产业化项目等重要研究课题。

以（共同）通讯/第一作者发表SCI论文465篇，他人引用25000余次，H-index为89。入选汤森-路透2015-2017年全球高被引作者。出版专著《现代无机非金属材料工艺学》、《先进陶瓷物理化学原理与技术》、《无机光学透明材料--透明陶瓷》三本。 以第一完成人获国家自然科学二等奖一项（2011年度）、上海市自然科学一等奖两项（2008，2014）和上海市科技进步一等奖（2009）一项等科技奖励。 另获两院院士评选中国十大科技进展（2005）、中国青年科技奖、中科院青年科学家奖、上海市自然科学牡丹奖、上海市科技精英等奖励。

本文由材料人编辑部魏巧琳编译，点我加入材料人编辑部。

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