Nat. Commun.: 单壁碳纳米角引发巨噬细胞中蛋白质导致细胞焦亡/凋亡提高纳米管的生物相容性

【引言】

单壁碳纳米角(SNH)是一种新型的纳米碳子，由于其独特的形态和结构而受到越来越多的关注。单个纳米角由一个直径为2- 5nm、长度为40 - 80nm的由sp2键结合的碳原子组成。由于原子排列的相似性，碳纳米管是SNH最接近的结构模拟。实际上，SNH继承了碳纳米管(CNT)的物理化学特征，在能量转换、化学工程、催化剂、燃料电池和电子应用等方面具有很大的潜力。SNH由于其结构特点，在合成过程中没有使用金属催化剂，在室温下可以大量生产，在生物医学应用中可能比CNT更具有优势。目前，SNH已被广泛报道为一个多功能的药物传递平台，在体内的光声成像、光热疗法等方面。然而，关于SNH的纳米安全性和生物相容性的研究还非常缺乏，更不用说它的分子机制了。另一方面，SNH与CNT的形态学差异很大。对于空心CNT来说，长宽比是影响其纳米毒性的关键因素，而由于球形结构，SNH在三维立体上近似各向同性。因此，从纳米毒性和原理上对这两种碳纳米管进行比较是非常必要的。

【成果简介】

近日，北京大学的张强教授（通讯作者）等报道了在细胞和分子水平的纳米毒性和机制中SNH与CNT之间的差异，从而绘制出由这两种纳米碳化物引起的细胞死亡的全貌。用巨噬细胞作为细胞模型进行研究。将SNH与四种纳米管相比较，包括单壁碳纳米管和多壁碳纳米管(MNT)。首次发现SNH和CNT在细胞摄取、碳管纳米诱导的细胞凋亡、坏死、焦亡、细胞因子分泌和蛋白表达、水解酶泄漏、溶酶体应激、膜干扰、与膜蛋白相互作用等多方面存在差异。重要的是，通过多种方法证明SNH比CNT具有更好的安全性和生物相容性。基于蛋白质组学和其他研究，一种关键的跨膜蛋白—糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B (GPNMB)被发现可以启动纳米毒性。与CNT组相比，SNH组中较弱的纳米-GPNMB的相互作用导致纳米膜相互作用的程度降低，溶酶体应激、细胞焦亡/细胞凋亡，最终导致巨噬细胞的低毒性，而坏死性凋亡、铁死亡、自噬和线粒体渗透性转移(MPT)依赖性坏死的参与基本被排除。研究成果以题为“Single-walled carbon-nanohorns improve biocompatibility over nanotubes by triggering less protein-initiated pyroptosis and apoptosis in macrophages”发布在国际著名期刊Nat. Commun.上。

【图文导读】

图一、巨噬细胞吞噬吸收的SNH、CNT对比 

（a） 细胞培养后细胞内的碳纳米的拉曼光谱图；

（b） 基于激光反射(LR)信号检测的五个碳纳米的相对细胞吸收比较；

（c） 碳纳米孵育后细胞的共焦图像；

（d） 碳纳米培养后细胞内溶酶体的透射电镜图像。

图二、SNH、CNT的纳米毒性对比 

（a） MTT法检测不同碳纳米的细胞存活率比较；

（b） LDH释放研究中检测到不同碳纳米的细胞存活率的比较；

（c） PI标记法测定碳纳米细胞的流式细胞分析；

（d） 带Baf和不带Baf的碳纳米孵育后细胞的共焦图像；

（e） 基于LDH释放实验的不同碳纳米的细胞毒性分析。

图三、SNH、CNT诱导的细胞凋亡和坏死对比

 （a） 不同碳纳米孵育后的PARP蛋白质印迹分析；

（b） 不同碳纳米孵育后的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1裂解蛋白质印迹分析；

（c） 基于蛋白质印迹分析的集成光密度(IOD)值检测，定量测定碳纳米孵育后细胞中的PARP的解理比；

（d） 基于蛋白质印迹分析的集成光密度(IOD)值检测，定量测定碳纳米孵育后细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的解理比；

（e） 蛋白质印迹分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9在碳纳米孵育后的裂解；

（f） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-DEVD-FMK对不同的碳纳米的细胞毒性检测；

（g） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK对不同的碳纳米的细胞毒性检测；

（h） 不同的碳纳米造成的死细胞的透射电镜图像；

（i） 碳纳米孵育后的细胞内ATP检测；

（j） 不同的碳纳米细胞孵育后的细胞外和细胞内HMGB1的免疫印迹分析；

（k） 基于WB成像的IOD检测中细胞外HMGB1与细胞内HMGB1的定量比率；

（l） 基于Annexin V/PI法测定碳纳米孵育后细胞的流式细胞分析；

（m） 细胞凋亡/坏死检测试剂盒检测不同的碳纳米引起的细胞凋亡和坏死的定量比较。

图四、SNH、CNT对蛋白表达的影响 

（a） LFQ蛋白组学研究纳米碳孵育后细胞蛋白变化的层次聚类分析；

（b） 碳纳米处理后，对照组细胞蛋白的维恩图表达变化超过40%；

（c） 基于富集分析的不同碳纳米孵育后上调蛋白的基因功能标注聚类；

（d） 基于富集分析的不同碳纳米孵育后下调蛋白的基因功能标注聚类；

（e） 热量图显示了在碳纳米孵化后参与部分关键细胞过程的改变蛋白的表达比较。

图五、SNH、CNT引起细胞焦亡的对比 

（a） 碳纳米孵育后RIP1和RIP3激酶的蛋白印迹分析；

（b） 添加和不添加RIP特异性抑制剂NEC1的不同碳纳米孵育的细胞毒性检测；

（c） 不同碳纳米对半胱氨酸天冬氨酸酶-1裂解的蛋白印迹分析；

（d） 基于集成光密度(IOD)值检测的半胱氨酸天冬氨酸酶-1裂解的蛋白印迹成像过程中的定量卵裂率测定；

（e） 基于特异性检测试剂盒的不同纳米碳细胞孵育后半胱氨酸天冬氨酸酶-1活性的测定；

（f） ELISA检测不同碳纳米引起的细胞外IL-1β测量；

（g） 基于蛋白质阵列技术的纳米碳诱导的细胞外的炎性细胞因子热图；

（h-I）不同碳纳米的细胞毒性检测，有无两种泛焦抑制剂。

图六、SNH、CNT引起的溶酶体压力对比 

（a） 细胞内碳纳米 (淡绿颜色)与线粒体(红色)的联合定位CLSM图像；

（b） 细胞内碳纳米 (淡绿颜色)与溶酶体(红色)的共定位CLSM图像；

（c） 利用CLSM测量不同碳纳米与线粒体进行共定位的参数；

（d） 利用CLSM测量不同碳纳米与溶酶体进行共定位的参数；

（e） 碳纳米培养后Bcl-2和Bak的蛋白印迹分析；

（f） 碳纳米细胞孵育后细胞内细胞器特异性蛋白细胞色素C(线粒体位置)的分布图像；

（g） 碳纳米细胞孵育后细胞内细胞器特异性蛋白组织蛋白酶B(溶酶体位置) 的分布图像；

（h-I）不同碳纳米与溶酶体膜相互作用的透射电镜图像。

图七、SNH和CNT诱导的细胞死亡机制示意图 

【小结】

研究了SNH和CNT之间的差异，在一系列的级联细胞毒性问题中得到了证实，多项研究也证实了在四种已建立的碳纳米管上，单壁纳米角的安全性和生物相容性得到了改善。首次发现一种转基因糖蛋白(GPNMB)与碳纳米结合并引发毒性事件。SNH和CNT具有明显的形态特征，在形态和程度上表现出不同的纳米蛋白和纳米膜相互作用，最终表现出不同的纳米毒性。有趣的是，这种纳米碳诱导的细胞毒性的差异基本上依赖于它们的单一结构单元的几何形状，而不是它们在介质或细胞内浓度中的分散形式。

文献链接：Single-walled carbon-nanohorns improve biocompatibility over nanotubes by triggering less protein-initiated pyroptosis and apoptosis in macrophages（Nat. Commun., 2018, DOI: 10.1038/s41467-018-04700-z）

本文由材料人生物材料组小胖纸编译。

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