Nature子刊：用于发现生物活性小分子的第二代DNA模板化大环化合物库

【引言】

新的生物活性小分子配体的发现仍然是生命科学研究界的核心努力方向。常见的小分子发现方法依赖于筛选化学化合物的大型集合（库）。在典型的筛查活动中，文库成员在不同的地点单独进行分析以获得所需的生物学活性，因此与筛查相关的时间，精力和费用与文库大小成正比。虽然化学文库的筛选取得了许多重要的成功，但大型化学文库的开发，维护和高通量筛选需要基础设施，资源和物流，而大多数研究小组都无法获得这些资源。此外，筛选试验的离散性质可能需要大量不稳定的生物材料，这些生物材料需要按比例放大以适应筛选的文库的大小。相比之下，选择方法在单个实验中评估整个文库，通常需要的生物材料的量少于单个微量滴定板测定所需的量。此外，选择不需要基础设施来分离，测定或操纵单个文库成员，并且以基本上独立于文库规模的方式消耗资源。

DNA编码化合物库(DNA Encoded Compound Library，简称DEL)是合成分子的混合物，每个合成分子由共价连接的DNA标签编码。自发现以来，这项技术已经得到很好的发展。DEL可以在一种解决方案中快速且便宜地同时测试整个文库，以便与感兴趣的目标结合，并且只需要少量的生物材料（每个选择约5-50μg的典型目标蛋白）。DEL技术是组合化学和分子生物学的完美结晶，并在高通量测序技术的迅速发展下得到了巨大的推动，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。

尽管有这些优势，但绝大多数DEL仍然局限于制药公司，围绕其在工业中的开发和使用的许多研究进展仍未公开。虽然已经报道了一些合成DEL的初始策略。在一些情况下，这些方法使得构建化合物数量高达数百万甚至数十亿的文库成为可能。但伴随着的却是随着文库大小的增加，可被确认经历预期反应途径的文库成分却减少。重要的是，DEL的质量取决于由其DNA标签编码正确合成的分子的比例，而文库的质量又直接影响选择结果的可靠性。可是，在大多数情况下，每个化学偶联步骤后都进行产物的纯化是不可行的，这导致连接DNA标签的截短的副产物污染甚至控制了文库。

当使用低效积木作为文库设计的一部分来挑战诸如大环化或偶联反应等化学转化时，这种限制可能变得特别成问题。因此，使用传统的方法来生成高质量的大环化合物DEL可能是一个特别的挑战，除非支架的大部分是预先形成的，而组合变化仅限于引入取代基，实际上这限制了文库结构的多样性。

因此，开发构建高度多样化DNA编码大环化合物库的方法是一个具有挑战性的目标，可以提供潜在的化学空间。 大环分子的生物医学特性进一步突出了这些文库的应用潜力。 目前，大约70种大环类药物已被批准用于人类使用，超过35种大环类药物处于临床开发的不同阶段。通常认为大环比其线性对应物具有更好的体内稳定性，并提供了灵活性和预组织之间的平衡，使得大环化合物可以跨越延伸的蛋白质结合位点进行相互作用，熵处理低于相应的线性分子。 后一个特征使它们在靶向表面或蛋白质 - 蛋白质相互作用方面很有前，而这些相互作用可能难以用常规小分子库进行靶向。

【成果简介】

DNA编码文库已经成为发现生物活性小分子的广泛使用的资源，并且与传统的小分子文库相比具有显着的优势。近日，哈佛大学美国杰出化学家David R. Liu（通讯作者）在Nature Chemistry期刊上发表了题为“Second-generation DNA-templated macrocycle libraries for the discovery of bioactive small molecules”的研究论文。在此项研究中里，作者开发并精简了DNA编码和DNA模板化文库合成方法的多个基本方面，包括20×20×20×80正交密码子的计算识别和实验验证，增强结构的化学和计算工具文库成员的多样性和药物相似性，高效聚合酶介导的模板文库组装策略以及文库分离和纯化方法。作者及其团队整合了这些改进的方法，以生成具有改善的药物物理性质的第二代DNA模板库，其中包含256,000个小分子大环化合物。该文库体外选择胰岛素降解酶亲和性产生新颖的胰岛素降解酶抑制剂，包括异常效力和新型大环化合物（IC₅₀ = 40nM）之一。总的来说，这些发展使得以DNA为模板的小分子文库成为用于生物活性小分子发现的更强大，可访问，简化和具有成本效益的工具

【图文导读】

图1：DNA模板的大环化合物文库合成示意图

展示了先前描述的第一代（灰色）和第二代（黑色，彩色）库合成的关键方面。在第一步中，连接在模板5'端的支架结构单元D与结构单元A进行偶联，结构单元A最初通过可裂解的 bis(2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl) sulfone (BSOCOES) 连接子连接到相应的'反密码子'DNA上。未反应的模板用乙酸酐加帽封端。连接子在高pH下被裂解，释放结构单元A的氨基，随后进行步骤2与构件B偶联，随后加帽和接头裂解。在与生物素或PEG标记的Wittig试剂结构单元C偶联后，用抗生蛋白链菌素标记的beads（第一代方法）或凝胶纯化（第二代方法）下拉可以分离在所有三个步骤中成功反应的那些模板。高碘酸盐处理裂解丙酰胺部分的二醇片段以提供乙醛酰基，其在温和的碱性条件下经历Wittig环化。成环产物在环化（第一代程序）时从beads上洗脱下来或在聚丙烯酰胺凝胶上纯化（第二代程序）。 EDC，N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳化二亚胺盐酸盐; sNHS，N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐。

图2：第二代DNA模板文库的正交密码子集的鉴定

a）第二代模板库的一般体系结构。连续的Ns不代表随机序列，但表示各个密码子的位置；

b）第二代图书馆的编码系统；

c）用于计算正交密码子集的DNA模板的建议模型；

d）DTS密码子反应性的理想结果（表1）。数字表示相应的DNA模板（水平）和DNA-连接的试剂（垂直）之间反应的表观转化。绿色和紫色字段分别表示明显的转换和退火因子；

e）基于附加退火因子模型的反卷积方法（7）：将实验获得的反应性表格（3）转换成预期的亲和表格（4），其用额外的DTS反应（5）精制。几何形状代表各种密码子和反密码子; （2）和（5）表示相应的DTS反应（α，β，γ）的表观转换。

图3：第二代DNA模板化大环化合物库的构建模块

a）能够将新的支架结构并入DNA模板的合成路线，例如支架4I和4L；

b）脚手架在第二代大型循环库中验证和使用，红色和绿色球体分别代表构件1和3的联系；在第一代文库中使用支架4A-4H（虚线框）；

c）经迭代选择的构建模块最大限度地提高了库与Kihlberg的参数空间的重叠，用于口服生物可用分子。 DCM，二氯甲烷; DIPEA，N，N-二异丙基乙胺; DMF，N，N-二甲基甲酰胺; HBTU，2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐; TFA，三氟乙酸。

图4：来自第二代大环文库和第一代文库的成员的物理参数分布

来自第二代大环文库的物理参数显示在x轴的上方，而来自第一代文库的物理参数显示在x轴的下方。 颜色表示在参考文献中所描述的理想的“beyond rule of five”（bRo5）参数范围内部（蓝色）或外部（红色）的值。

图5：DNA模板库的组装方法

a）组装第一代DNA模板库；

b）用于第二代DTS库的夹板连接组装的修改版本。将连接片段的数量从两个增加到三个，大大减少了所需的寡核苷酸合成的数量；

c）通过预备的酶促引物延伸的模板库装配策略。

图6：体外选择256,000元DNA-模板化的大环化合物库用于结合IDe

a，b）在计算过滤九个结构相似的疏水结构单元（1J，1L，1M，1N，1T，3E，3H，3L，3R）之前（a）和之后（b）的IDE选择结果。除去大量的非特异性噪音更突显出丰富的DJP *系列大环化合物。化合物trans-DJPM和cis-DJIR是在无DNA下化学合成的，并且发现它们与第一代DNA模板化文库中发现的反式-6bK和反式-6bA大环结构相当。确定的命中还包括一个无关的、新结构家族的CODVV大环。 R =（CH₂）₂O（CH ₂）₂NH₂；

c）通过荧光十肽切割测定确定的大环命中的浓度依赖性IDE抑制曲线。误差线表示平均值的标准差。每次命中的顺式和反式异构体的图具有相同的颜色和标记形状，但反式异构体为填充的符号和顺式异构体为空心符号。 DJPM反式异构体比顺式异构体更有效，但测试的其他命中却观察到相反的趋势。

【小结】

本文开发并合成了第二代DNA模板化和DNA编码的256,000个大环化合物文库，适用于体外选择和高通量DNA测序。在文库合成过程中，作者开发并广泛优化了DNA编码和DNA模板库技术的许多基本方面。这些进展包括以下内容：

（1）提出并实验验证了用于鉴定DTS文库合成的正交密码子的新模型，其导致20×20×20×80密码子集足以支持多达640,000个成员的文库。

（2）除了增加脚手架密码子的数量（从8个增加到32个或80个）外，我们还开发了一种高效的DNA兼容的beads上Boc去保护方法，并验证了许多新的构建模块，这些构建模块共同充分扩展了脚手架，构建模块化大环的多样性。

（3）开发了计算机脚本以帮助生成化合物文库的计算机数据库，并选择能够提高所得分子预测生物利用度的构建模块。

（4）为DNA连接的小分子开发了新的分离和纯化方法，使得DTS文库更可靠，可扩展，高收益和成本效益更高，并且在选择后能够回收和回收文库。

（5）开发了新的聚合酶辅助方法来合成具有5'化学修饰的DNA模板文库。这些方法提供了对文库质量的更精确控制，消除了与寡核苷酸混合物进行反应的必要性，并且通过在链霉抗生物素蛋白连接的beads上不可靠的固定和从标准沉淀方法的不良恢复而使材料损失最小化。

（6）最后，通过针对IDE的体外选择验证了新的文库合成方案，导致发现对先前优化的IDE抑制剂6bK（IC₅₀ = 50nM）等效的大环trans DJPM，并且发现cis-DJIR（IC₅₀ = 40 nM），这是一种意想不到的IDE顺式大环骨架配体IDE抑制剂，代表了一种新型的结合IDE的大环化合物。

文献链接：Second-generation DNA-templated macrocycle libraries for the discovery of bioactive small molecules. (Nat. Chem., 2018, DOI: 10.1038/s41557-018-0033-8）

本文由材料人生物组Jing供稿。

材料牛网专注于跟踪材料领域科技及行业进展，这里汇集了各大高校硕博生、一线科研人员以及行业从业者，如果您对于跟踪材料领域科技进展，解读高水平文章或是评述行业有兴趣，点我加入材料人编辑部。

材料测试、数据分析，上测试谷！