ACS Nano：生物基质中纳米粒子的表征

【引言】

工程纳米材料在包括肿瘤治疗、医学成像、抗菌剂制备等的生物医药领域有着广泛的应用。然而，就目前研究来看，我们对纳米粒子与生物分子之间的相互作用及纳米粒子输送至细胞后的表现知之甚少，一定程度上阻碍了纳米材料在生物医学领域的发展。

纳米粒子应用于细胞内存在潜在的危险性。虽然过去几十年里有关纳米安全性的研究急剧增加，但是关于功能纳米材料的毒性同其物理、化学性质的关系一直没有明确的解释。此外，实验中体内与体外结果相互矛盾的情况也引起了人们的关注。而这都源于当前研究缺乏一种可靠的生物基质中纳米粒子的表征方法。

纳米粒子在体外合成并修饰后，进入体内会吸引蛋白质等生物分子在其表面形成蛋白晕，改变表面的理化性质及电荷，从而使得粒子与粒子之间的排斥力改变，相互碰撞，形成团聚体。此时如果增加给药剂量，则会达到一个生物可利用剂量，不可否认，当功能纳米粒子处于一种多相团聚体状态或存在于复杂的生理环境中时，当前的技术不足以确定生物可利用剂量。因而，开创一种可以在生物基质中准确表征纳米材料的可靠方法对于功能纳米材料在生物医药领域的应用十分必要。

【成果简介】

近日，英国斯旺西大学的Huw D. Summers教授（通讯作者）团队在ACS Nano上发表了题为“Characterizing Nanoparticles in Biological Matrices: Tipping Points in Agglomeration State and Cellular Delivery In Vitro”的研究论文，文中就目前对于生物基质中纳米粒子可靠表征手段的缺乏，提出了一种利用低温快照取样的团聚体三维重建及TEM表征生物基质中纳米粒子的方法（3-D CSS-TEM），达到量化“生物可利用剂量”目的。

【图文导读】

图1：纳米颗粒在生物基质中团聚

（a） 20 nm和40 nm的PS纳米颗粒同正常血清培养基（NSCM）及减少血清的培养基（RSCM）中的TK6细胞孵育24小时后，细胞平均摄取量（归一化纳米颗粒荧光值/细胞）；
（b, c）荧光显微镜照片，其中红色为细胞膜，绿色为纳米颗粒，可以看出在50 nM给药量时，20 nm的PS纳米颗粒大量吸附与RSCM中TK6细胞表面。

表1：

在给药和血清环境（NSCM / RSCM =正常/减少的含血清培养基）上的动态光散射表征聚苯乙烯纳米颗粒团聚状态和表面电荷（ζ电位）表征使用累积量（“Z-平均”）分析方法

图2：使用低温快照取样及TEM对团聚体状态PS纳米颗粒进行表征

图中电子显微镜照片中a/b/c/d均为20 nm PS颗粒，g/h均为40 nm PS颗粒CSS-TEM表征后结果，展示了在给药量为10或者50 nM 1小时后纳米颗粒的团聚状态；

（b）和（e）的不同与纳米颗粒有团聚更大的趋势是吻合的；

（c. f. i）分别为通过相应的CSS-TEM数据得到的团聚分布图。

图3:20 nm PS纳米颗粒的细胞递送剂量调整

（a / b）通过旋转测量的五种不同尺寸团聚体的体积及面积；
使用通过约100个图像倾斜系列实验收集的电子显微照片来测量不同尺寸的团聚体（参见，视频S1为全分辨率视图）；

（a）这些测量数据（圆圈）经验地验证了用于将2-CSSTEM团聚体面积数据转换为估计的团聚体体积（线=转换的CSS-TEM数据）的缩放模型；

（c / d）估计的团聚体积分布，
通过将标度模型应用于2-D CSS-TEM数据获得的分布，在（NSCM，蓝色）或减少（RSCM，红色）含血清培养基中正常施用的10或50nM的纳米颗粒剂量；

（e / f）细胞荧光分布，与单个细胞给药体积几乎成线性关系，
从图1a所示的组合的成像细胞计数据构建的每个细胞的纳米颗粒剂量（带有重叠轮廓的直方图）；

（g / h）样品在（e/f）所示分布下的荧光显微照片（绿色=纳米颗粒），
随着团聚体尺寸不均匀性（c / d）增加递送剂量（e / f）中的细胞与细胞之间的差异显着增加。

图4：通过纳米粒子团聚转化50nM给药剂量的20nm PS

（a）估计的在正常（NSCM，蓝色）或还原（RSCM，红色）含血清培养基中的不同团聚状态下的纳米粒子总量作为团聚体数量百分比和团聚体积的乘积； 

（b）在每个血清环境中，给药剂量的累积分布函数，涵盖从最大尺寸到最小尺寸的团聚体。

图5. DLS测试

从DLS研究（表1）中提取的20nm PS和40nm PS聚集体流体动力学尺寸分布数据（星号），并与通过CSS-TEM（圆圈）直接测量的附聚物Feret直径测量值进行比较。

（a / b / g）为使用水作为分散剂收集的结果，单独测量的主要尺寸分布，还包括从滴铸TEM显微照片获得的纳米颗粒直径（绿线）以提供单个纳米颗粒相对于团聚物的尺寸参考点（即主要尺寸对照）；

给药后1小时测量大小分布（黑色），正常（NSCM，蓝色）或还原（RSCM，红色）血清中的10nM（左图; a / c / e / g / h）或50nM（右; b / d /媒体；

包括NSCM和RSCM的DLS尺寸分布作为介质对照检测血清分子的光散射背景以确保目标纳米颗粒可靠地检测。

图6.单独使用DLS检测异常聚集状态：BASF Levasil二氧化硅纳米粒子（SiO₂）

（a / c）DLS测量的16nm SiO₂动态光散射粒径分布；

（b / d）DLS测量的85nm SiO₂纳米颗粒尺寸分布（星号）。

图7：纳米SiO₂对正常或含血清培养基细胞活力和DNA损伤的影响

含有生长培养基的（NSCM，蓝色）或减少血清（RSCM，红色）培养基中，将TK6细胞暴露24小时至（a）16nm SiO₂或（b）85nm SiO₂（n = 6，误差线= SD）。 暴露对细胞活力（细胞生长/细胞毒性）的影响用相对于未暴露的对照培养物的相对种群倍增（系）进行评估。 通过双核细胞微核率评估DNA损伤（条），直到细胞活力降低到50％以下。 （●，⧫，★）在p <0.05，p <0.01和p <0.001的情况下，相对于未控制的对照的响应统计学显着性；

（a）在> 15nM的施用剂量下，16nm的SiO₂在血清环境中显示出明显不同的细胞活力趋势；

（b）相比之下，无论血清环境如何，85nm SiO2暴露的细胞活力数据保持高度相似。

图8：含有正常或含血清培养基的SiO₂纳米颗粒的细胞传递

为了解在正常（NSCM，蓝色）和还原（RSCM，红色）血清环境中的二氧化硅纳米颗粒的细胞递送，在暴露24小时后进行切片细胞的电子显微镜，使用能量色散X射线（EDX）分析以确定纳米颗粒（假色绿色）。

（a / b）与NSCM（a）相比，在血清环境中，16 nm二氧化硅（73nM剂量）的细胞递送显着变化，观察到与RSCM中的细胞膜结合的纳米颗粒的量更大（b）；

（c/d）相比之下（，无论血清环境如何，85nm SiO₂（0.5nM剂量）的细胞递送保持高度相似。 比例尺= 1微米。

【小结】

本文提出了一种新的表征生物基质中纳米粒子的方法3-D CSS-TEM，可以实现对多相团聚状态的纳米颗粒及生理环境中的纳米颗粒的表征，这对于纳米医药领域把控给药剂量，理解细胞递送、摄取及毒性十分有利。

文献链接：Characterizing Nanoparticles in Biological Matrices: Tipping Points in Agglomeration State and Cellular Delivery In Vitro. (ACS Nano, 2017, DOI: 10.1021/acsnano.7b03708 )

本文由材料人编辑部生物材料组Jing供稿，材料牛编辑整理。

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