激光共聚焦显微镜要点解析

激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察例如Ca2⁺，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

一、基本原理和功能

1. 1　基本原理

传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管( PM T)或冷电耦器件( cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,
这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。

1. 2　激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能

1）“细胞CT”功能

通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。

2）三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能

激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。例如: 可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。

3）将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合

利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变
化。如细胞内游离Ca²⁺、pH值及其它细胞内离子的实时测定。荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。

1. 3　激光共聚焦显微成像仪的细胞生物学功能

1）粘附细胞分选技术

Ul tima 型激光共聚焦显微成像仪是目前世界上唯一能对粘附细胞进行分选的仪器,而这种不改变细胞周围培养环境,细胞铺展程度和生长状态的分选方式是至关重要的。

2）细胞激光显微外科及光陷井技术

该仪器可将激光当作一把“光刀子”使用,完成诸如细胞膜瞬间穿孔,染色体切割,神经元突起切除等一系列细胞外科手术,也可以作光陷井操作。

3）荧光光漂白恢复技术

该技术用来测定活细胞的动力学系数。通过对活细胞的动力学系数的测定,可对细胞骨架构成、核膜结构、大分子组装和径跨膜大分子迁移率等领域进一步研究。

二、应用

2. 1　细胞内游离钙测定

2. 1. 1　细胞的获取　

细胞内游离钙的测定需要活的生长旺盛的细胞。其来源可从细胞株培养获得,也可由动物活体直接取得。培养优良的细胞,是一件非常辛苦又花费精力的工作,但它可以确保每次都有足够多的细胞供实验使用;从动物的活体上直接取细胞,需要实验人员高超的手术技巧,能准确地摘取标本,并且尽量避免细胞的丢失和死亡。

2. 1. 2　细胞的染色　

根据各种细胞的特性和活性,确保每次染色成功,是技术性很强的实验技术,需要一段摸索的时间。首先确定加多大浓度的钙敏荧光染料FLUO-3/AM,在CO₂培养箱中孵育多长时间, 是否需要加去污剂F-127助溶?这些在几次试验以后才能够确定。

2. 1. 3　细胞的粘附　

如果培养的是粘附细胞,那么它们会较为牢固地粘附在培养皿上或载玻片上,可是悬浮的细胞如血小板,红细胞很难贴壁。为了解决这个问题必须对载玻片进行处理。处理主要方法为使用多聚赖氨酸,蛋清,聚乙烯醇等作粘贴剂。

2. 2　细胞通讯

2. 2. 1　确定原细胞通讯情况　并非所有的细胞都有这种缝隙连接的通讯,例如: 淋巴细胞,部分癌细胞就没有这种通讯,因此,必须预先对原细胞作用出判断。

2. 2. 2　细胞通讯测定结果的统计学处理　

由于细胞处于不同的生长期,即使同一细胞系,其恢复速率也不完全一致。这就必须取得尽可能多的标本数据来进行统计。

2. 2. 3　观察细胞的选择　

在一个视野里有若干个细胞。作为数据采集对象必须选择3 组细胞为观察目标: ( 1)对照组: 选孤立的单个细胞1～ 2 个,由于此类细胞与其它细胞不相连接,因而就不会有细胞通讯的机能,适合用作对照;( 2)观察组: 选相互紧密相连的细胞5～ 6 个,这种细胞间存在通讯,可作为测试对象; ( 3)校正组: 选相互紧密相连的细胞1～ 2个,不用激光去淬灭,用于作空白校正,这是因为细胞在激光照射下,其荧光强度会产生自然漂白,为消除这种因素影响,必须对背景进行校正。

三、激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较

光学显微镜的基本结构主要由机械部分、照明部分和光学部分(反光镜、聚光镜、光圈、目镜、物镜等)组成。激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)则是在20 世纪80 年代推出的高科技产品,其基本结构比光学显微镜要复杂, 它除了包括光学显微镜部分之外, 主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集, 处理, 转换、应用软件)、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统(如光学滤片, 分光器, 共聚焦针孔及相应的控制系统)等部分组成。由此可见, 两种显微镜在构造上最大的区别就在于LSCM 具有结构复杂的计算机系统、激光系统、扫描装置和共聚焦系统。

在光源方面, 由于两者性质的不同, 所成像的清晰度也有明显的区别。光学显微镜的光源大致可分为两类, 一是自然光, 一是内置灯源。可见光经反光镜、聚光镜的作用, 对全视野进行照明, 即场光源, 也就是说它只能对标本局部厚度作平面成像, 这样不仅要求标本为薄切片(5 ～ 10μm), 而且标本上任何一点的图像都会受到邻近点的衍射光和散色光的影响, 降低了图像的反差和分辨率。LSCM 采用单色激光作为光源, 并用附设的小孔光阑-针孔(pinhole)使光源成为点光源, 与光学显微镜的场光源相比, 共聚焦显微镜的点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。LSCM 除了在照明光源前有一个针孔(pinhole)外, 在检测器前方也有一个针孔, 光源针孔和检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的,也就是光点通过一系列的透镜最终可同时聚焦于光源针孔和检测针孔, 也就是所谓的“共聚焦” 。光源以激光扫描束的形式形成点光源对样品进行逐点扫描, 通过扫描移动装置使得样品光源照射点始终位于焦平面处, 也就是使样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上, 其产生的光信号由检测针孔后的光电倍增管逐点接收后, 转变为电信号传输至计算机, 在屏幕上呈现为清晰的整幅焦平面的图象。点光源可通过对样品进行左右、上下的扫描来获得厚标本(可达400μm)不同层面的图像, 亦即可对细胞或组织厚片进行类似CT 断层扫描的无损伤性连续光学切片(optical sectioning), 连续光学切片经计算机三维重建的处理, 能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。而传统的光学显微镜即使通过石蜡连续切片等繁琐的步骤也难达到LSCM 在三维重建方面的效果。

光学显微镜的分辨率可用物镜的分辨率来表示,此外, 光学显微镜不仅从焦平面上收集光量, 而且还收集来自焦平面上、下的光量, 使分辨率大大降低。与光学显微镜相比, LSCM 的分辨率除了与光的波长有关外, 主要取决于针孔的直径与物镜的数值孔径。

参考文献：

[1] 李楠, 王黎明, 杨军. 激光共聚焦显微镜的原理和应用[J]. 军医进修学院学报, 1996, 17(3): 1-3

[2] 霍霞. 激光共聚焦显微镜与光学显微镜之比较[J]. 激光生物学报, 2001, 10(1): 1-3

材料人编辑部Allen编辑整理。