学术干货 | 紫外可见分光光度计的结构、原理与应用

一、什么是紫外可见分光光度计？

紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器，无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域，还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门，紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。

分光光度计是杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人在1854年将朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。紫外可见分光光度法从问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。目前，分光光度法已为工农业各个部门和科学研究的各个领域所广泛采用，成为人们从事生产和科研的有力测试手段。目前市场上有两类主流产品:扫描光栅式分光光度计和固定光栅式分光光度计。

紫外可见分光光度计有着较长的历史，其主要理论框架早已建立，制作技术相对成熟。但构成紫外可见分光光度计的光、机、电、算等任何一方面的新技术都可能再推动紫外可见分光光度计整体性能的进步。在追求准确、快速、可靠的同时，小型化、智能化、在线化、网络化成为了现代紫外可见分光光度计新的增长点。

二、紫外可见分光光度计的发展

分光光度法在分析领域中的应用已经有数十年的历史，至今仍是应用最广泛的分析方法之一。随着分光元器件及分光技术、检测器件与检测技术、大规模集成制造技术等的发展，以及单片机、微处理器、计算机和DSP技术的广泛应用，分光光度计的性能指标不断提高，并向自动化、智能化、高速化和小型化等方向发展。

在分光元器件方面，经历了棱镜、机刻光栅和全息光栅的过程，商品化的全息闪耀光栅已迅速取代一般刻划光栅。在仪器控制方面，随着单片机、微处理器的出现以及软硬件技术的结合，从早期的人工控制进步到了自动控制。在显示、记录与绘图方面，早期采用表头(电位计)指示、绘图仪绘图，后来用数字电压表数字显示，如今更多地采用液晶屏幕或计算机屏幕显示。在检测器方面，早期使用光电池、光电管，后来更普遍地使用光电倍增管甚至光电二极管阵列。阵列型检测器和凹面光栅的联合应用，使仪器的测量速度发生了质的飞跃，且性能更加稳定可靠，受到仪器用户的青睐，最具有代表性的当数安捷伦的HP8452/8453。在仪器构型方面，从单光束发展为双光束，现在几乎所有高级分光光度计都是双光束的，有些高精度的仪器采用双单色器，使得仪器在分辨率和杂散光等方面的性能大大提高，如Varian(瓦里安)的Cary1/3/400。随着集成电路技术和光纤技术的发展，联合采用小型凹面全息光栅和阵列探测器以及USB接口等新技术，已经出现了一些携带方便、用途广泛的小型化甚至是掌上型的紫外可见分光光度计，如OceanOptics(海洋光学)的S系列、USB2000及PC2000。而光电子技术和MEMS技术的发展，使得有可能将分光元件和探测器集成在一块基片上，制作微型分光光度计。我国重庆大学在微型多通道光谱仪方面开展了卓有成效的研究工作，承担的国家自然科学基金项目“微型多道光谱分析系统集成化技术研究”已经通过了技术鉴定。随着发光二极管(LED)光源技术及产业的日益成熟，以LED为光源的小型便携又低廉的分光光度计已成为研究开发的热点。除了空间色散的分光方式，也有人对声光调制滤光和傅立叶变换光谱在紫外可见区的应用进行了研究。

仪器的软件功能可以极大地提升仪器的使用性能和价值，现代分光光度计生产厂商都非常重视仪器配套软件的开发。除了仪器控制软件和通用数据分析处理软件外，很多仪器针对不同行业应用开发了专用分析软件，给仪器使用者带来了极大的便利。

三、紫外可见分光光度计的结构

一般地，紫外可见分光光度计主要由光源系统、单色器系统、样品室、检测系统组成，如图1所示。光源发出的复合光通过单色器被分解成单色光，当单色光通过样品室时，一部分被样品吸收，其余未被吸收的光到达检测器，被转变为电信号，经电子电路的放大和数据处理后，通过显示系统给出测量结果。

图1.紫外可见分光光度计结构

分光光度计的主要部件如下所述。

光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)；氙灯：紫外、可见光区均可用作光源。

单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。

棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。

光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。

吸收池：用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池；紫外区：石英池。

检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管。

检流计（指示器）：刻度显示或数字显示、自动扫描记录。

四、紫外可见分光光度计的原理

物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比，其数学表示式如下

A=abc

A—吸光度；a—摩尔吸光系数；b—吸收介质的厚度；c—吸光物质的浓度。

4.1光学系统原理

由光源钨灯和氘灯发出的复合光经由步进电机控制带动反光镜M1，反射通过入射狭缝，并进入单色器中，光栅衍射出的单色光经准直镜M2调焦，会聚通过出射狭缝，光束到达斩光器时，一段时间内的光射成为参比光路，另一段时间内的光透射成为样品光路。最后两光交替地照射在检测器(光电倍增管)，如图2所示。

图2.光学系统原理图

4.2电器系统原理

光电倍增管检测出的信号经由前置放大器，驱动卡传递给微机控制器，由微机控制器推动驱动卡居中协调各部分，如图3所示。

图3.电气原理图

五、紫外可见分光光度计的特点

分光光度法对于分析人员来说，可以说是最常用和有效的工具之一。几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。分光光度法具有以下主要特点。

5.1 灵敏度高

由于新的显色剂的大量合成，并在应用研究方面取得了可喜的进展，使得对元素测定的灵敏度有所推进，特别是有关多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万。

5.2 选择性好

目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。

5.3 准确度高

对于一般的分光光度法，其浓度测量的相对误差在1～3%范围内，如采用示差分光光度法进行测量，则误差可减少到0.X%。

5.4 适用浓度范围广

可从常量(1%～50%)(尤其使用示差法)到痕量(10-8～10-6%)(经预富集后)。

5.5 分析成本低、操作简便、快速、应用广泛

由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素(除少数放射性元素和惰性元素之外)均可采用此法。在国际上发表的有关分析的论文总数中，光度法约占28%，我国约占所发表论文总数的33%。

六、紫外可见分光光度计的技术性能指标评述

光谱范围　紫外可见光谱区通常指190nm～780nm的波长范围，但实际的分光光度计设计中，经常将波长向长波方向拓展，进入短波近红外区。在120多种国外产品中，有52种波长≤900nm，其中≤800nm的仅11种。而>900nm的有72种，占了多数。固定光栅型受硅阵列探测器的限制，1100nm是其波长的上限。扫描光栅型使用分立光电器件，波长的扩展更为灵活。最特殊的是Varian的Cary6000i(175～1800nm)、Shimadzu的UV3101PC(190～3200nm)和Jasco的V-570(190～2500nm)，通过切换光栅和探测元件，使仪器的光谱范围覆盖了紫外、可见和近红外区，可满足一机多用的需要。

波长的准确性：仅有16种偏差超过1nm，其余大多在01～1之间。其中突出的是Varian的Cary100/300，它们在6561nm处的波长准确性达到了002nm的水平。波长重复性大于05nm的仅7种，01～05nm之间的占了多数，共有68种，还有相当数量的产品达到了优于01nm的水平。如Agilent的8453(002)、Beckman的DU7000series(005)、Camspec的M400T/PC(005)、GBC的Centra10/20/40(004)、Hitachi的U3010/3310(005)、PerkinElmer的Lambda系列(002～005)、ScincoCO的S-1100/3130/3150(002)、Shimadzu的MS1500(001)和UV1201(003)、Varian的Cary系列(0008～0025)等。虽然从原理上，固定光栅型的设计结构固定、简单，易于实现好的波长准确性和重复性，但扫描光栅的设计制造工艺已十分成熟，从性能指标看，最突出的Cary系列、Lambda系列都是扫描光栅型的产品。

分辨率：扫描光栅型通过改变狭缝宽度可选择分辨率，Varian的Cary4000最高做到了005nm，上海分析仪器总厂的760mc也可达到008nm。固定光栅型受到阵列探测器的长度和像元数量限制，除非光谱范围很窄，否则分辨率是很难高于0.1nm量级的。

扫描速率：大多在100～4000nm/min，Varian的Cary50最高实现了24000nm/min，Cary4000也有20000nm/min。但与固定光栅型最短ms量级完成全光谱测量的速度相比，仍是较慢的。

吸光度：普遍可达到2～3A的水平，共有80种产品最大光度值在2～3A之间，另有28种产品可以量测超过3A的样品。其中，最高的是Varian的Cary4000，达到了7A。其余，如SpectronicUnicam(Ther-moSpectronic)的NicoletEvolution300/500和UV510/520(6A)、Shimadzu的UV2401/2501/310PC(5A)、Jasco的V550/560、GBC的Centra5/10/20/40(5A)等也有很高的水平。

杂散光：典型值是0.01～0.05%T，在国外的产品中共有65种产品的杂散光指标在这一范围中。杂散光超过0.05%T的产品有31种，小于0.01%T的产品有19种。其中，最为突出的是Varian的Cary4000/6000i和Shimadzu的UV3101PC，它们的杂散光水平达到了令人惊讶的0.00008%T。从其光学设计看，都采用了双单色器。与扫描光栅型产品相比，固定光栅的分光光度计少了出射狭缝，实现低杂散光的难度更大。从性能指标来看，范围是0.01～1%T。26种固定光栅型产品中杂散光在0.01～0.05%T之间的有13种，也已达到半数，但是能够低于0.01%T的很少。

我国的紫外可见分光光度计，性能指标总体上接近国外的中等水平，缺少高档产品。考察6家国内企业的27种产品的主要技术指标。波长准确性，国外的典型水平是0.1～1nm。国内产品中，处于此范围的有16种，基本达到同一水平，但没有优于0.1nm的产品。国内产品的光度准确性大多以透过率表示，水平比较接近，均在0.3～0.5%T之间。在10%T处，也就是吸光度为1A处，将光度准确性以吸光度表示，则数值为0.013～0.021A。与国外产品有比较明显的差距。国内产品的光度重复性基本在0.1～0.3%T范围，同样在吸光度1A处换算，数值为0.004～0.013A，也存在距离。比较国外与国内产品的杂散光的典型值，两者几乎相差了一个数量级。但是已有一些较新研发的产品，可以达到国外产品的普遍水准。例如北京瑞利分析仪器公司的UV2100(0.05T%)、北京普析通用仪器有限责任公司的TU-1901(0.02T%)、上海分析仪器总厂的761crt(0.03T%)。基线稳定性方面，国产分光光度计与国外产品基本持平。但是，有些国内产品给出此项指标时，标明的测试时间仅为30或15分钟。从这些基本指标的比较来看，国产紫外可见分光光度计的准确性和可靠性仍然是有待提高的。另一方面，在仪器的控制、操作，数据的显示、处理、分析上，国内产品表现出迅速向国外产品靠拢的趋势。以功能更强的内置微机或外接PC取代单片机，利用外接PC的显示器或采用大面积LCD代替简单的LED数字显示，提升软件水平。在此基础上，分光光度计可具有开机自检、波长自动校正、基线自动记忆等功能；配备有更友好界面的操作软件，能够以文件形式存取光谱，显示光谱曲线，可对图形作扩展、压缩、求导、平滑、寻峰等处理；可完成单波长或多波长的定量、动力学等分析。在6个国内厂家的产品中都已出现了此类分光光度计。目前，我国的紫外可见分光光度计至少在以下三个方面存在比较明显的滞后。一是高档的科学分析型产品。能够满足精密的科学研究和分析的很少，采用双单色器，具有突出性能的国产分光光度计基本是空白。二是阵列探测器的应用。我国的产品仍以扫描光栅型为主，采用阵列探测器的固定光栅型分光光度计虽然已经起步，但进入市场的仍然罕见。三是光纤的使用。市场上以光纤探头取代传统样品室的设计，或可选择外接光纤附件的国产紫外可见分光光度计十分缺乏。

七、紫外可见分光光度计的应用

7.1 检定物质

根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λ max和摩尔吸收系数ε，是检定物质的常用物理参数。

7.2 与标准物及标准图谱对照

将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。

7.3 比较最大吸收波长吸收系数的一致性

由于紫外吸收光谱只含有2～3个较宽的吸收带，而紫外光谱主要是分子内的发色团在紫外区产生的吸收，与分子和其它部分关系不大。具有相同发色团的不同分子结构，在较大分子中不影响发色团的紫外吸收光谱，不同的分子结构有可能有相同的紫外吸收光谱，但它们的吸收系数是有差别的。如果分析样品和标准样品的吸收波长相同，吸收系数也相同，则可认为分析样品与标准样品为同一物质。

7.4 反应动力学研究

借助于分光光度法可以得出一些化学反应速度常数，并从两个或两个以上温度条件下得到的速度数据，得出反应活化能。

7.5 纯度检验

紫外吸收光谱能测定化合物中含有微量的具有紫外吸收的杂质。如果化合物的紫外可见光区没有明显的吸收峰，而它的杂质在紫外区内有较强的吸收峰，就可以检测出化合物中的杂质。

7.6 氢键强度的测定

不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂。

7.7 络合物组成及稳定常数的测定

金属离子常与有机物形成络合物，多数络合物在紫外可见区是有吸收的，我们可以利用分光光度法来研究其组成。

八、紫外可见分光光度计的展望

紫外可见分光光度计虽然是一类有着很长历史的分析仪器，但每一次吸收了新的技术成果都使它焕发出新的活力。扫描光栅型分光光度计依托成熟的设计制造工艺，并结合计算机控制等新的技术成果，仍有很强的生命力。在很多方面，扫描型产品仍代表了最高的技术水平。阵列式探测器的产生直接促成了固定光栅分光光度计的设计，使得它在测量地更快、更稳定、适应性更强的方向迈出了一大步。并且，从今后的发展来看，仪器的小型化、在线化，测量的现场化、实时化将是一大方向。要使分光光度计走出实验室，成为一种应用更广，更为普及的测量分析设备，阵列式探测器以及其它的固态式设计可发挥重要的作用。光纤也将是其中的一项重要技术，它已使得紫外可见分光光度计的使用变得更方便，同时也使分光光度计的配置变得更灵活。光纤结合模块化设计，可能使得分光光度计可以突破完全固定、静态的组成，而变成可以自由搭配，自助式构建的仪器。光纤同时也是实现在线测量的重要手段。计算机技术的影响将更为增进。分光光度计的自动化、智能化是一个方面。另一方面，软件已经在一定程度上使实在的仪器接近了虚拟的程序，网络和信息技术的结合可能带来进一步的影响。除了传统的空间色散的分光方式，声光调制滤波和傅立叶变换光谱也以其各自的特点表现出了在紫外可见波段的应用潜力。

参考文献：

[1] 倪一,黄梅珍,袁波等.紫外可见分光光度计的发展与现状[J],现代科学仪器,2004,3:3-7.

[2]吴文铭.紫外可见分光光度计及其应用,生命科学仪器[J],2009,7;61-63

本文由材料人编辑部孟令晓供稿，材料牛整理编辑。

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