干货|荧光分光光度计的原理及应用
一、荧光分光光度法原理
1. 分子荧光的产生
(1)电子激发态的多重度
单重激发态S:电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。
三重激发态T:电子自旋方向和处于基态轨道的电子平行。
(2)分子能级与跃迁
基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级):吸收特定频率的辐射。
激发态→基态:多种途径和方式;速度最快、激发态寿命最短的途径占优势;
2. 激发光谱与荧光光谱
(1)荧光的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 (图中曲线I ) 。激发光谱曲线的最高处,处于激发态的分子最多,荧光强度最大;
(2)荧光光谱
固定激发光波长, 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。问题:荧光(磷光)的激发光波长如何选择?Stokes位移:激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。
3. 荧光强度和溶液浓度的关系
(1)定量依据
4. 荧光、磷光分析方法的特点
(1)灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级;为什么?
分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别,荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。
(2)选择性强
既可依据特征发射光谱,又可根据特征吸收光谱;
(3)试样量少
(4)可提供比较多的物理参数
缺点:应用范围小。
二、荧光分光光度计的组成
测量荧光的仪器主要由四个部分组成:激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点:有两个单色器,光源与检测器成直角。基本流程如图:
单色器:选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器;
光源:氙灯和高压汞灯,染料激光器
检测器:光电倍增管
三、荧光分析法的应用
1. 无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量;可测量约60多种元素。
铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法;
氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定;
铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定;
铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定;
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
2. 生物与有机化合物的分析,见表 :
本文转自百度文库D粇,链接:https://wenku.baidu.com/view/fc59a757bed5b9f3f90f1c9f.html。
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