干货丨荧光与荧光显微镜知识点梳理

1. 荧光

当某种物质受到波长较短的光波照射时,会发射出波长较长的光。若切断照射光后仍能发光,称之为磷光；若照射停止后光立即熄灭,这种光称之为荧光。荧光发光机理可按量子理论通俗解释: 光具有波动、粒子二重性,光波愈短,其光子能量愈强；反之波长愈长其能量则弱。当某些物质受到紫外线或较短波长光照射,吸收了全部或部分光能量,使其分子的能级升高而处于亚稳定状态,当恢复到稳定的基态时,这些分子就会立即释放多余的能量,其中一部分化为热量而消失。但对某些物质而言,向基态跃迁时是以“光”形式释放,因为有部分能量被消耗,所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小,光波愈长,所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。

磷光的能量较荧光还要小,所以它的波长比荧光要长,寿命可达数小时之久,这就是两者的区别。

激发物质发出荧光的照射光称之为激发光,也是该物质吸收光,它的光谱包含紫外线、蓝光,现已扩展到黄绿光波段。

荧光光谱色随物质的差别和所用荧光色素的不同也有区别。它的光谱与可见光一样,红、橙、黄、绿、青、蓝、紫全有,有的物质标本只有一种颜色荧光,但有的有多种颜色荧光。

荧光可分为自然荧光和人工荧光两种：

自然荧光(或称一次荧光、自发荧光、自体荧光和原发荧光): 某些物质勿需经过处理,当受到激发光照射就能产生荧光的称为自然荧光。如植物的叶子、茎；动物的一些组织:牙齿、骨质、爪甲、白头发、尿液、血浆及维生素等；某些结晶体、有机化合物、合成物、油类、蛋白质、腊等。所以自然荧光在造纸、纤维、染料、化学药品、食品和油脂等工业方面被用作检查和鉴别。在环保中对大气污染公害的监测中也用紫外线进行粉尘荧光观测。

荧光显微镜初期就用于观察动、植物标本的自然荧光。

人工荧光(或称二次荧光、继发荧光、染色荧光): 某些物质必须经过化学处理,如用染料——荧光色素与其结合,才能在激发光下发射荧光。所谓荧光色素是一类能产生明显荧光,并能作为染料使用的有机化合物,它有天然和人工合成两类,后者常用的有数十种之多,如吖啶橙、罗达明等。荧光色素也叫作荧光染料,这样非荧光试样通过有选择的荧光色素进行染色后,在荧光显微镜下就可从颜色和反差中清晰地分辨其中不同的细胞组织。染色荧光方法在细胞化学和组织化学中很早就应用了,如用盐基黄(Auramine)对结核菌染色是常见的。

免疫荧光是利用抗原抗体能进行特异性结合的免疫化学特性,以荧光色素标记已知的抗体(或抗原)作为试剂,在特定条件下检测未知的抗原(或抗体)。借助于荧光显微镜观察抗原抗体结合物的荧光现象,从而可对抗原抗体物质进行定性、定位观察。此技术已被广泛应用于医学和生物学多种领域之中,并在标准化、定量化、自动化三方面达到较先进水平。免疫荧光也称为荧光抗体法,它在1950年由美国生物学家D.Coo ns试验成功,并获得诺贝尔奖。几十年来在细菌学、病毒学、免疫学、免疫病理学、寄生虫学、肿瘤学方面得到应用。荧光在农业科学、生物学、古生物学、兽医学等方面也获得广泛应用。

2. 荧光的特性

归纳起来,荧光具有以下特性：

(1)物质欲发射荧光,必须吸收激发光能。在常温下所发出的荧光波长较激发光长,能量较激发光弱(Stokes定律)。

(2)荧光的吸收光谱和发射光谱大致对称于某轴分布,形成镜象关系,它的吸收光波段A和发射光波段B大约在150nm范围内,之间的峰值距C则随物质而异,最大相距约为180nm,小的约为30nm ,但大多数激发光谱长波部分常常与发射光谱短波部分重叠在一起。

FITC的吸收和发射光谱曲线

物质荧光的光谱特性是固有的,当它接收特定的激发光(吸收),就会发出固有荧光色,因此依据荧光的特异性可判断是什么物质。

(3)荧光发出时不象普通光那样会产生热效应,它是冷光。荧光随激发光停止照射时,在10^-7 s～10^-8 s间内消失。

(4)荧光发光方向与激发光的方向无关,它呈球体辐射。

(5)荧光的衰减与猝灭。荧光的衰减是指在受激发光照射期间,发出的荧光光强的减弱。衰减的程度取决于激发光强度和照射时间。采用高强度激发光时其衰减要显著得多,有时在1秒的间隔内,荧光就会大大减弱。荧光还有猝灭现象,特别对于继发荧光,这是一种复杂的现象,由于处于激发状态的荧光发色团分子发生了变态,导致荧光量子产量的减少,这样便缩短了荧光的发射。

(6)荧光的光强I荧一般是较弱的,荧光效率约在0.1～ 0.9之间,通常只在0.3～0.4。它由下式决定

I荧 = R × Z
R——吸收光强,它仅占光源能量的一小部分；Z——小于1的系数。

(7)荧光具有偏振性

表1列举了常用的荧光色素的平均吸收波长、荧光平均波长和峰值间隔。表中数值可用显微光度计或分光光度计和荧光光度计在荧光色素染色标本上测定。

测定物质的吸收光谱和荧光光谱是非常重要的,特别对于新的色素必须测定。所测数据以文件形式记录,可作为设计荧光显微镜的基本依据。

3. 荧光显微镜

荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具,它是光学显微镜的一种。它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外,基于荧光的特性,还具备以下独特的功能要求:

(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。

(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片,从光源中选择合适的激发光谱,使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合,以期望获得最大的荧光。

(3)为获得较弱的荧光图像,还要建立一套截止滤色片,它使所需观察的荧光进入系统成像,而将其余的光波,包括发射光阻挡在外,用来提高图像的衬度。

(4)放大的光学系统应适应荧光的特性,最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度的荧光图像。

(5)仪器的安全性。应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸,保证电器安全。

4. 光源

荧光显微镜光源的选择取决于所需检测的荧光物质的吸收光谱,从表1中可见,荧光色素的平均吸收波长峰值从紫外(340nm)到黄绿光(595nm)。具有这些光谱的强光源有超高压汞灯、超高压氙灯和大功率的卤素灯。超高压汞灯是荧光显微术中最常用的光源,它是利用金属汞蒸汽在超高压下放电发光原理制成的。光度极强,可达2×10⁸ cd/m²～3×10⁸ cd/m³,发光光谱为280nm～600nm,具有不连续的线条光谱特性,有的波段特别明亮。下图是HBO—200W光谱能量分布,在紫外（UV)区有296.6nm、302.3nm、312.5nm、313.2nm、 334nm和365nm等波峰,其中365nm是最强的峰值,也是应用最广的紫外激发光。其次在蓝光区(B)有404.7nm和407.8nm及434.8nm～435.3nm峰值,绿光(G)区中有546.1nm和黄光区(Y)577nm,它用于激发罗达明B200的光源。

HBO—200W发射光谱曲线

超高压汞灯(HBO)发光时,泡内产生50～70个标准大气压,它的引燃电压很高,工作时维持电压较低,约为50V～60V,电丝电流在4A左右,灯的寿命与启动次数和工作时间有关。启动次数愈多,每次工作时间愈短,寿命愈短。生产厂在出厂时应给出规定平均寿命,如德国莱茨公司规定每启动一次工作3h,共启动70次为准,平均寿命为200h；日本奥林巴斯公司平均寿命是400h。使用中,当灯泡变黑或达规定时间应调换灯泡 ,否则除了灯的光度下降外,而且还有可能出现爆炸事故。熄灭时一般约15分钟方完全冷却,在未完全冷却时,切勿打开灯室,因热灯泡内压力很大,聚冷会引发爆炸。因此在说明书上应予强调并要求统计使用时间 ,填写记录,注意安全。

超高压氙灯(XBO)是利用惰性气体在超高压(30个标准大气压)下放电发光原理制成的。它的发光光谱与太阳光谱相近,是连续光谱,波峰在400nm～450nm之间,光谱较平缓,而且有丰富的连续紫外线,是良好的紫外和蓝光激发光源,它的光度也极强,如XBO—75W的光度在1.5×10⁸ cd/m²～4×10⁸ cd/m²之间,它的色温在 6000°K以上,是日光的色温,所以是彩色摄影极好的照明光源。其优点是操作方便,启动立即点燃,点燃后即使立即熄灭,也不会损坏灯泡,寿命很长。发光过程中,弧光稳定,色温不变,其缺点是需专用的低压直流电源箱,灯的温度极高,价格比汞灯更为昂贵。

卤素灯是在石英灯壳内充入卤族元素溴或磺,充溴的叫溴钨灯,能发出强烈的连续可见光谱,它的体积小,重量轻,价格最便宜,适用不需要紫外线激发的荧光显微镜中作激发光源。如医院中用FITC(异硫氰酸荧光黄)进行常规诊断时,需要蓝光490nm波段激发时,用12V 100W卤素灯就很合适。

光源选择其次要考虑它的功率,选用大功率还是低瓦数的灯泡? 原则上讲应尽可能选用低瓦数的光源,无疑这对结构设计和成本是有利的。但过低的瓦数在激发时不能激发出荧光或发出荧光不稳定,就不能使用 了。而能否激发出荧光又与整个成像系统的光能利用相关,能充分合理有效地利用光能,瓦数就可以降下来,单纯地追求大功率光源作为荧光检测并不可取,还会引发荧光的衰减和猝灭。当前供应的落射荧光显微镜仅配备100W的汞灯或氙灯和卤素灯。

在选择光源时,还需注意到弧光尺寸,即光源发光区的大小。如汞灯50W 弧光尺寸为1.0×0.3mm,200W为2.2×0.5mm,而100W为0.25×0.25mm。能否正好充满系统的入瞳使光能充分利用,对一个优良的荧光显微镜,各种倍率的物镜“光能”皆可充分有效的利用是一个值得关注的指标。

在荧光显微镜设计中,光源选择在总体设计中是至关重要的,它决定了仪器的使用范围和成本,也反映了仪器的档次。实验室以上的显微镜应以汞灯为主光源,简易型(专用)的显微镜则以卤素灯为主光源。

5. 滤色片

滤色片是荧光显微镜的关键部件,在荧光显微镜中按其功能可分为激发滤色片和截止滤色片两类。激发滤色片的功能是从光源中分析出所需的特定光谱,以激发标本产生荧光。截止滤色片的功能是仅把标本上发出的荧光透过成像,而将其它光阻挡不参与成像,一般激发滤色片安置在紧靠光源,而截止滤色片在物镜与目镜之间，按其透过光谱特性曲线可分为“短波通过”、“长波通过”和“波段通过”滤色片。波段通过滤色片按波带宽度又可分为“宽波带”和“窄波带”滤色片,如果半宽带(即HW=50%的透射峰的主透射带的宽度之半)大于50nm,视为“宽波带型”；若小于20nm,则可视为“窄波带型”。

滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体,后改用带色胶质片,由于易变色和使用不方便已被淘汰。现在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片,透过波段宽,透过率随厚度而降低,价格相对低廉。由于色玻璃与空气的界面上,约有4%光线被反射掉,玻片愈多,光能损失愈大,限制了它的使用性能。干涉滤色片的出现,可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片,从而促使荧光显微术的进展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。

从表1可见,多数荧光色素和荧光发色团分子具有相当宽的吸收光波带和荧光波带,峰值间隔又较大,所以需要得到强荧光时,很少使用窄波带滤色片,因为它致使相当大的光源能量损失了(没有利用),仅在光源的强发射谱线和激发时的吸收峰相重合时才使用。当使用宽波带滤色片时,往往组织成分和光路中的自发荧光会被这类滤色片中的短波光激发出来,加到荧光图象中而混扰。多数应用中,激发滤色片的半宽约20nm就能给出满意的结果。

用滤色片(色玻璃和干涉滤色片)选取光源中的部分光谱段以获得荧光物质的激发光以及发挥相应的截止作用从原理上讲是完全可以的,但不可能配备那么多滤色片去适应所有的荧光物质的需要。如何建立最小的滤色片系列,组合后使之满足各种不同的要求,这是设计者必须要认真权衡的问题。除了功能考虑外,还要注意成本和滤色片寿命。色玻璃和干涉滤色片价位比,目前相差百倍,一些软膜干涉滤色片的寿命仅两年有效。因此设计者必须关注“用户”需要,经常使用那些荧光色素,对于特殊要求的可作为选用件特殊处理。

对于激发滤色片一般按激发光谱分为: 紫外区(UV)波段在340nm～380nm,小于400nm；紫/蓝区(V)波段在390nm～460nm；蓝光区(B)波段在460nm～500nm；绿光区(G)波段在500nm～570nm,目前还有黄光区(Y)波段在570nm～595nm之间,各厂家在各激发区内还进行细分。细分的原则是按不同的激发波带宽度和峰值,如在B激发中分为400nm～490nm；420nm～490nm；450nm～490nm；465nm～495nm和470nm～490nm 5种。

6. 光学成像系统

荧光显微镜的光学系统必须完成两个主要功能:

(1)要有效地激发试样中荧光反应物,使用的发射波长最好接近它的吸收峰；

(2)必须尽可能多地收集发出的荧光,以便使显微镜内可见度最合适。

荧光光学系统的成像质量主要取决于像的衬度和像的亮度,像的衬度是由样品中激发出的荧光与背景上观察到的光之比决定的。背景光包括透过截止激发光的滤色片的杂散激发光,样品组织成分的自发荧光和光学系统的自发荧光和杂散光,在荧光显微术中尽全力要解决的是既获得最佳的像衬度,同时又维持像有足够亮度,这两者往往是矛盾的。例如用极窄波带滤色片激发时仅利用了极少的光能,背景暗了但荧光亮度也弱了。在应用时,只能兼顾,合理的权衡以决定取舍。

荧光显微光学系统需要优先考虑的是:

(1)光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料,不但指光学系统玻璃也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光,不但会增加背景光,有时还会混淆观察荧光图像。

(2)光学系统的参数选择中,应将获得最大光能作为第一考虑因素。

照明系统中集光镜应选用最大的包容角；采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳,以期望获得高效率的均匀照明。

收集荧光成像的物镜,因为像面照度与数值孔径 NA²成正式,为此作为荧光用物镜应有较大的NA值。目前10×已达0.5；20×达0.75；40×达0.9；油镜40×达1.3。

双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率,采用镀膜技术可大大地减少光能的损失,它可比一般双目镜筒透射率提高一倍,这对弱荧光物质观察是必须的。

(3)作为荧光光学系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的,特别是紫外光要通过的部件,如照明系统,聚光镜以及物镜,要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料。照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好,因为铝在UV和V区反射率在90%以上,而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线,在紫外区通过处不宜用作胶合剂。

本文转载自作者杨广烈，材料牛石小梅编辑整理。

参考文献

[1] 杨广烈. 荧光与荧光显微镜[J]. 光学仪器,2001,(02):18-29.

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